盐酸纳美芬联合迷走神经电刺激对肺缺血-再灌注损伤大鼠肺组织强啡肽及IL-17 的影响

徐标 李文华 吴威

武汉市第四医院（华中科技大学附属武汉普爱医院）（武汉 430035）

肺缺血-再灌注损伤病理变化表现为肺泡-毛细血管网状结构通透性增高，进而引起间质水肿及炎性细胞浸润、肺泡上皮细胞损伤及凋亡，最终导致肺水肿、通气/换气功能障碍，其发病机制可能与炎性介质释放增加等因素有关［1-3］。目前对肺缺血-再灌注损伤的防治研究手段单一、效果不佳且药物防治研究多集中于“预防作用”，即在缺血期前给药，然而在面对休克、心肺复苏等危重症救治过程中已经发生肺缺血-再灌注损伤的病理生理状态时如何治疗，目前却研究甚少，更缺乏多种治疗方式联合应用的研究。近期研究表明迷走神经电刺激可减轻急性肺损伤［4］，而纳美芬可通过抑制TLR4 信号通路减轻肺缺血-再灌注损伤［5］。因此本研究将纳美芬、迷走神经电刺激联合应用于大鼠肺缺血-再灌注损伤模型，探讨多种治疗方式联合应用能否更有效地防治肺缺血-再灌注损伤及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级雄性SD 大鼠75 只，动物许可证号：SCXK（鄂）2010-0009，体质量（200±50）g，购自同济医学院动物实验中心，在洁净动物饲养室内自由摄食、饮水。饲养室温度保持在20～25 ℃，相对湿度保持在50%～70%。

1.2 主要药物、试剂与仪器盐酸纳美芬注射液（商品名：乐萌，成都天台山制药有限公司产品），规格：1 mL：0.1 mg，批准文号：国药准字H20080645，批号：11210502161。兔抗大鼠强啡肽、κ受体、IL-17单克隆抗体（美国Santa Cruz 公司）。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）试剂盒（南京建成生物工程研究所）。BCA 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。C9000光密度扫描仪（日本岛津公司）。BL-420 型生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立、分组与给药将75 只大鼠随机均分为5 组，每组15 只。（1）模型组：参考何义等［6］方法开胸游离左肺门后，夹闭左肺门45 min（肺组织由淡红色变成暗紫红色，表明缺血阻断成功）后解除阻断，观察5 min 后肺组织膨胀、颜色恢复（表明肺组织循环再灌注成功），继续再灌注3 h。（2）迷走神经电刺激组：预先分离出左侧颈迷走神经，参照模型组方法于再灌注成功时进行迷走神经电刺激，频率30 Hz，脉宽0.5 ms，电流1.0 mA，刺激总时间为30 min（方法参考文献［7］），同步继续再灌注肺组织3 h。（3）纳美芬组：参照模型组方法于再灌注成功时即刻尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。（4）纳美芬+迷走神经电刺激组：预先分离出左侧颈迷走神经，参照迷走神经电刺激组于再灌注成功时进行迷走神经电刺激，同时尾静脉注射纳美芬（15 μg/kg），余处理同模型组。（5）假手术组：只开胸游离左肺门，不行夹闭，在上述各组大鼠相同时间点尾静脉注射等体积生理盐水及处死大鼠。各组大鼠于再灌注3 h 后经右颈总动脉采血留取血标本后处死大鼠，留取左肺上叶组织待检。

1.3.2 大鼠动脉血气分析取大鼠动脉血标本经血气分析仪检测动脉血pO2值、pCO2值。

1.3.3 大鼠肺组织湿/干重（W/D）测定取左肺上叶组织，以0.9%氯化钠溶液冲洗后用滤纸吸干多余水分后称重，计量为湿重（W）；置80 ℃恒温箱，烘烤72 h 至恒重后称重，计量为干重（D）；计算肺组织W/D。

1.3.4 大鼠肺组织病理学观察将左肺上叶组织置于4%多聚甲醛中固定24 h 后切成5 μm 的石蜡切片，HE 染色后光镜下观察肺组织病理形态变化。

1.3.5 大鼠肺组织MPO 测定切取大鼠肺组织相应部位0.5 × 0.5 × 0.5 cm3称重，加入肺组织10倍重的生理盐水，置入匀浆器中在冰水中匀浆。再以4 000 r/min 离心5 min，分别吸取0.1 mL 上清液按照MPO 测定试剂盒提供的方法测定MPO含量。

1.3.6 Western blot 检测大鼠肺组织强啡肽、κ 受体、IL-17表达取大鼠肺组织100 mg/份，匀浆后加入适量组织蛋白裂解液，离心后吸取上清，按照BCA 蛋白定量试剂盒操作。样品经15%SDS-PAGE分离后，转移于硝酸纤维素膜上。以1∶1 000 的兔抗大鼠强啡肽、κ 受体、IL-17 单克隆一抗4 ℃静置孵育过夜，再以1∶15 000 过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗室温孵育2 h，用ECL 试剂盒发光显影，同时检测GAPDH 的表达作为内参对照。图像经扫描仪扫描，重复3 次。采用凝胶图像分析系统检测蛋白质迹条带灰度，测定并计算强啡肽、κ 受体、IL-17 与GAPDH 表达灰度的比值。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0 软件行方差分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析和LSD-t检验进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠动脉血气分析及肺组织湿/干重比值与模型组比较，迷走神经电刺激组、纳美芬组的湿/干重比值、动脉血pCO2值均显著降低，动脉血pO2值显著升高（P＜0.01）。与迷走神经电刺激组比较，纳美芬组湿/干重比值、动脉血pCO2值、pO2值差异均无统计学意义（P＞0.05）。与纳美芬组、迷走神经电刺激组比较，纳美芬+迷走神经电刺激组湿/干重比值、pCO2值均显著降低，pO2值显著升高（P＜0.01），见表1。

表1 各组大鼠动脉血气分析及肺组织湿/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

表1 各组大鼠动脉血气分析及肺组织湿/干重比值Tab.1 Arterial blood gas analysis and lung tissue wet/dry weight ratio

注：与模型组比较，aP ＜0.01；与迷走神经电刺激组比较，bP ＞0.05，cP ＜0.01；与纳美芬组比较，dP ＜0.01

2.2 大鼠肺组织病理变化模型组、迷走神经电刺激组、纳美芬组、纳美芬+迷走神经电刺激组均可见肺泡间隔破坏，部分肺泡萎陷，肺间质水肿明显、见炎症细胞浸润和红细胞渗出。假手术肺组织结构完整清晰，肺泡腔内无炎症细胞浸润，肺间质无渗出。在病变程度和病变范围上，纳美芬+迷走神经电刺激组比迷走神经电刺激组、纳美芬组明显减轻（图1）。

图1 各组大鼠肺组织病理变化（HE×100）Fig.1 Pathological changes of lung tissue in each group（HE×100）

2.3 大鼠肺组织MPO 水平与模型组比较，迷走神经电刺激组、纳美芬组MPO 表达显著降低（P＜0.01）；与迷走神经电刺激组比较，纳美芬组MPO表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与纳美芬组、迷走神经电刺激组比较，纳美芬+迷走神经电刺激组MPO 表达均显著降低（P＜0.01），见表2。

2.4 大鼠肺组织强啡肽、κ受体、IL-17表达水平与模型组比较，纳美芬组强啡肽、κ 受体、IL-17表达均显著降低（P＜0.01），而迷走神经电刺激组强啡肽、κ 受体表达差异无统计学意义（P＞0.05）、IL-17 表达显著降低（P＜0.01）。与迷走神经电刺激组比较，纳美芬组强啡肽、κ 受体表达均显著降低（P＜0.01）、IL-17 表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与纳美芬组、迷走神经电刺激组比较，纳美芬+迷走神经电刺激组强啡肽、κ 受体、IL-17 表达均显著降低（P＜0.01），见图2、表2。

图2 各组大鼠肺组织强啡肽、κ 受体和IL-17 表达（Western blot）Fig.2 Expression of dynorphin，κ-receptor and IL-17 in lung tissue of rats in each group（Western blot）

表2 各组大鼠肺组织强啡肽及MPO、κ 受体、IL-17 表达水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

表2 各组大鼠肺组织强啡肽及MPO、κ 受体、IL-17 表达水平Tab.2 Expression of dynorphin and MPO、κ-receptor and IL-17 in lung tissue of each group

注：与模型组比较，aP ＞0.05，bP ＜0.01；与迷走神经电刺激组比较，cP ＜0.01，dP ＞0.05；与纳美芬组比较，eP ＜0.01

3 讨论

阿片肽与其受体的相互作用在炎症反应中发挥重要作用［8-9］。强啡肽是目前已知的活力最强的内源性阿片肽，是κ 阿片受体的内源性配体［10］。研究表明阿片肽与肺泡细胞表面受体结合后可诱导细胞凋亡，导致肺泡—毛细血管网状结构通透性增高、肺间质水肿［11］。阿片肽物质与免疫细胞表面特定阿片肽受体结合后能诱导炎症细胞活化增殖、释放IL-17 等炎性细胞因子导致细胞损伤［12］。MPO是多型核粒细胞的一种标志性酶，其活性和组织中中性粒细胞的浸润程度成正比，是反映中性粒细胞浸润的可靠指标［13］。IL-17 是一种强有力的中性粒细胞趋化及激活因子，可早期特异性地出现在炎症部位［14］，在肺组织炎症启动中发挥主要作用。在急性肺组织损伤过程中，IL-17可趋化巨噬细胞、中性粒细胞大量聚集、诱导炎症反应发生导致肺组织损伤，同时随着肺组织损伤加重，肺组织中IL-17 表达明显升高［15］。本研究发现肺缺血-再灌注损伤组大鼠肺泡组织炎症反应（表现为MPO、IL-17 表达水平明显升高）、肺功能损害（表现为动脉血pO2值下降、pCO2值升高）明显加重，而肺组织中强啡肽及κ 受体表达水平亦明显升高，表明肺组织中强啡肽与受体相互作用在肺缺血-再灌注损伤后介导粒细胞浸润、促进炎症反应过程中发挥重要作用。纳美芬作为阿片肽受体拮抗剂可加速阿片肽物质降解，经纳美芬处理后，肺组织中强啡肽水平明显降低，κ 受体表达水平也随之下降，炎症反应程度亦明显减轻，推测纳美芬抑制肺缺血-再灌注损伤的作用机制可能与加速强啡肽降解、抑制κ 受体表达水平，减轻炎症反应有关。体内胆碱能抗炎通路（cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP）将神经系统和免疫系统紧密联系起来［16-17］。迷走神经激活后传出纤维释放乙酰胆碱，直接或间接地作用于肺泡巨噬细胞的表面的α7n ACh R（胆碱能受体）［18］，抑制NF-κB等信号通路的转导，降低炎症因子的表达来减轻炎症反应。既往研究表明迷走神经电刺激释放乙酰胆碱可以降低IL-6 等炎性因子的表达从而控制炎症的级联反应，减轻肺组织损伤［19-20］。给予迷走神经电刺激后，肺组织中强啡肽及κ 受体表达水平无显著变化，但炎症反应程度明显减轻（MPO、IL-17 表达水平明显降低），推测迷走神经电刺激可能通过CAP 来减轻缺血-再灌注损伤时肺组织中的炎症反应。将迷走神经电刺激和纳美芬联合应用后，肺组织中强啡肽及κ 受体表达水平、炎症反应程度较之单独应用纳美芬出现明显下降，表明联合应用迷走神经电刺激可以增强纳美芬降解强啡肽、抑制炎症反应的作用，推测肺组织内胆碱能抗炎通路与阿片肽—受体炎症通路可能存在交叉、级联反应，具体过程尚需进一步研究。本研究表明迷走神经电刺激与纳美芬联合应用于防治肺缺血-再灌注损伤可产生协同、增效作用，鉴于目前国外已出现体表外的颈部迷走神经电刺激仪器［20］，若能在临床上将物理疗法与药物治疗结合起来，多种方式联合应用防治肺缺血-再灌注损伤，有利于克服单一疗法的效果局限，发挥各自优势，其应用前景将进一步广阔。