荧光素酶nanoKAZ与发光底物的分子对接及对接复合体的全原子动力学模拟

吴 楠, 宋奕凝, 季宝成, 白艳红

(郑州轻工业大学 食品与生物工程学院， 郑州 450001)

1 引 言

荧光素酶是生物发光成像技术的核心，将其标记在目标生物大分子上，通过测定酶催化产生的光信号可以实现对标记物的非侵入性监控. 荧光素酶具有高检测灵敏度，无毒，易操作，成本低，良好的标记稳定性以及标记传代性，现已广泛应用于医疗，制药，生物科研等各个行业[1]. 最近，荧光素酶在高灵敏度病毒检测[2]，病毒致病机制分析[3]，以及抗病毒药物筛选[4]方面的应用研究报道逐年增多. 考虑到近年来在我国SARS-CoV，H7N9以及最近的COVID-19等病毒引起的公共安全问题频发[5]，荧光素酶技术的诸多优良特性将保证其在病毒的研究和防治中承担越来越重要的角色.

nanoKAZ是一种通过蛋白质工程改造的荧光素酶，改造基体是荧光素酶OplophorusLuciferase(OLuc). OLuc源于一种深海发光磷虾Oplophorusgracilirostris，可以催化底物coelenterazine (CTZ)的氧化反应产生峰值为460 nm的蓝光[6]. 分离纯化后的OLuc分子量为130 kDa，经western blot检测发现OLuc由分子量为35 kDa和19 kDa的两个小蛋白亚基组成[7]. 发光活性测定实验表明OLuc的催化区位于19 kDa蛋白亚基上. 目前已有课题组向该亚基引入16个氨基酸位点突变优化发光活性，所构建突变体被命名为nanoKAZ. 相较其他荧光素酶nanoKAZ具有以下两个优点：1)分子量小，在标记过程中不会对标记分子的理化性质产生较大影响；2)对底物专一性依赖程度低，可以通过开发底物类似物的方法较方便且高效改造nanoKAZ的催化发光性质[8]. 因此nanoKAZ被认为是一种潜在理想的报告蛋白.

目前nanoKAZ的晶体结构已被报道(PDB ID：5BOU). 结构显示nanoKAZ为单结构域分子，主要由11个反平行β折叠(β1-β11)形成的桶状结构(β桶)与4个α螺旋(α1-α4)构成. 除α1外，其余三个α螺旋(α2-α4)在空间上靠近，与β桶间围城一个大小可容纳一个CTZ分子的空腔(图1A). 空腔内疏水性高且富集正电荷，被认为是nanoKAZ的潜在催化腔[9]. 然而，目前该催化腔与底物的结合模式仍然未知，其主要原因是nanoKAZ催化底物反应速度极快，难以解析nanoKAZ与CTZ结合复合体的结构. 由于缺乏nanoKAZ与底物结合模式的信息，目前nanoKAZ的改造研究进展缓慢.

本研究利用nanoKAZ结构信息，采用分子对接和分子动力学模拟技术对nanoKAZ的潜在催化腔与底物的作用过程进行模拟，解析nanoKAZ与底物的结合中间态，观察底物对nanoKAZ主链运动性造成的影响，查找nanoKAZ分子中与底物发生直接作用的氨基酸残基位点，对nanoKAZ的分子改造提供了有效信息，也为提升nanoKAZ的应用价值打下了前提和基础.

2 材料与方法

2.1 材 料

本研究使用软件为分子动力学模拟软件：GROMACS(Ver. 2019.1)[10]；酶与底物结合自由能计算与分解软件：g_mmpbsa(Ver. 5.1.2，含APBS计算程序组件)[11]；二级结构计算软件DSSP(Ver. 3.0.0-2)[12];分子对接软件：AutoDock(Ver. 4.2)与 AutoDockTools(Ver. 1.5.6)[13]；分子结构可视化软件：PyMOL(Ver. 2.3.2).

2.2 方 法

2.2.1分子对接

在蛋白结构数据库Proten Data Bank(https://www.rcsb.org/)中下载nanoKAZ的结构文件(PDB ID：5BOU)，使用PyMOL软件将A链结构导出并保存(图1A). 在小分子结构数据库The Automated Topology Builde(ATB，http://atb.uq.edu.au/)绘制并下载底物CTZ的分子结构文件(ID: J2J4)并保存(图1B). 分别将nanoKAZ与CTZ的结构文件导入分子对接工具AutoDock Tools，调整对接格点盒子大小使其完全包裹住nanoKAZ的中心空腔并开展对接实验. 在对接过程中使用拉马克遗传算法(lamarckian genetic algotithm)进行配体构象搜索，其余对接参数均为默认设置.

图1 构建的nanoKAZ(A)与coelenterazine(B)的三维分子结构Fig. 1 Three-dimensional structures of nanoKAZ (A) and coelenterazine (B)

2.2.2分子动力学模拟

分子动力学模拟采用GROMACS 2019软件包，设定蛋白质力场为GROMOS96 54A7，水分子使用SPC模型，底物分子的拓扑文件与力场参数均通过ATB服务器计算获得. 分别以nanoKAZ的单酶apo态(apo-nanoKAZ)和nanoKAZ与底物的对接复合体(nanoKAZ-CTZ)为中心，构建直径为7.471 Å的立方体盒子并添加水分子进行溶剂化，生成初始模拟体系. 两体系中均加入7个钠离子中和nanoKAZ自身的7个负电荷，使构建体系保持电中性. 其后对构建体系建立周期性边界条件，通过最速下降法使体系能量最小化后，先后使用100 ps的NVT系综模拟和100 ps的NPT系综模拟平衡体系. 温度由V-rescale耦合算法稳定在300 K，压强由Parrinello-Rahman恒压器方法维持在1 bar(1×105Pa). 平衡后两体系均在NPT系综条件下继续进行200 ns动力学模拟. 所有模拟过程中，时间步长均设定为2 fs，每10步(20 fs)重建一次临近列表. 所有化学键的键长以LINCS方法加以限制，范德华力与静电力相互作用分别使用Lenard-Jones函数与PME方法进行计算，截断半径均设为1.4 nm.

3 结 果

3.1 筛选最优对接复合体

使用AutoDock对nanoKAZ与CTZ进行对接后共生成50个复合体构象，其中16个构象中nanoKAZ与CTZ结合方式高度类似(RMSD≤0.2 nm)，形成最大构象簇(抑制常数316.72 μM)，且该簇在所有构象簇中能量最低(-4.77 kJ/mol)，因此被选为最优对接构象. 考虑到酶与底物在溶液中对接过程应具有动力学特性，而半刚性对接构象搜索难以完全体现真实环境中酶与底物的作用方式，因此在对接完成后，对nanoKAZ-CTZ复合体进行了200 ns分子动力学模拟. 同时，也在相同模拟条件下对apo-nanoKAZ进行了200 ns动力学模拟做为对照，用以分析CTZ对nanoKAZ酶结构造成的影响.

3.2 CTZ对nanoKAZ结构稳定性的影响

模拟完成后，首先以30 ns的瞬时结构做为对比模版，分别计算了apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ在200 ns模拟期间所有输出结构Cα的均方根方差(Root-Mean-Square Deviation，RMSD). 结果显示在模拟过程的前100 ns期间，apo-nanoKAZ构象变化剧烈，100 ns后结构趋于稳定，虽然在165 ns时出现约0.05 nm左右幅度短暂的RMSD震动(维持时间小于10 ns)但整体构象变化不大，可以判断apo-nanoKAZ已经处于稳定状态，RMSD稳定值在0.24 nm左右. 另一方面， nanoKAZ-CTZ复合体在130 ns模拟后RMSD趋于稳定，稳定值约为0.23 nm，与apo-nanoKAZ的模拟结果接近，说明底物的加入对nanoKAZ整体结构稳定性的影响程度较低(图2).

图2 nanoKAZ-CTZ与apo-nanoKAZ中蛋白结构RMSD随时间变化情况 Fig. 2 RMSD changes of nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ versus time duration

apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ的二级结构稳定性使用DSSP加以分析，结果显示复合体nanoKAZ-CTZ中除α3螺旋(L30-L34)外所有二级结构在模拟条件下均可维持稳定. α3螺旋结构则在复合体模拟进行至100 ns左右逐渐消失为无结构loop. 与之相对，apo-nanoKAZ内的α3螺旋结构在200 ns全程维持完好(图3)，该结果表明α3螺旋在复合体内受到较强能量作用导致维持其二级结构的氢键断裂，致使其最终被破坏.

图3 nanoKAZ-CTZ与apo-nanoKAZ中二级结构成分(SS contents)随时间的变化情况 Fig. 3 Secondary structure (SS) contents changes of nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ versus time duration

3.3 nanoKAZ与CTZ的结合能计算与氢键分析

nanoKAZ与CTZ的结合自由能通过Molecular Mechanics/Poisson Boltzmann Surface Area (MM/PBSA)方法计算. 首先，基于RMSD结果截取了nanoKAZ-CTZ复合体在190 ns至200 ns模拟区间(结构相对稳定)的分子运动轨迹(每1 ns截取一个快照)，然后利用软件包g_mmpbsa分别计算选取轨迹内nanoKAZ与CTZ间的相互作用能ΔEMM(包含范德华ΔEvdw和静电相互作用ΔEele),去溶剂化极性效应能ΔEsolv以及去溶剂化非极性效应能ΔESASA，最后利用公式ΔGbind=ΔEvdw+ΔEele+ΔGsolv+ΔGSASA计算出体系的结合自由能ΔEbind.计算结果显示整个复合体结合能ΔEbind主要来源是ΔEvdw，其次分别是ΔEele和ΔESASA.去溶剂化极性效应能ΔEsolv则是唯一的结合阻力来源，其绝对值大于ΔEele和ΔESASA但小于ΔEvdw，故被抵消.复合体的最终结合能为-193.412 ±3.799 kJ/mol(表1).

表1 使用MM/PBSA方法计算nanoKAZ-CTZ复合体的结合自由能

对体系进行能量分解获取单个氨基酸与CTZ间的结合自由能贡献信息. 结果显示共计15个氨基酸残基对底物的结合自由能超过-2 kJ/mol，其中10个氨基酸残基位于β桶区域，包括直接位于β折叠的7个氨基酸残基Q12(β1)，P40(β2)，I56(β3)，V58(β3)，L92(β5)，F151(β10)，C164(β11)和 3个位于β6-β7间长loop的氨基酸残基Y109，F110，R112；另外5个氨基酸位于α2-α4螺旋或周边区域，包括L18(α2)，L22(α2)，V27(α2至α3间loop)，F31(loop，原α3区域)和F77(α4)(图4A，4B).

氢键分析结果显示，上述残基中的Q12和V27在120 ns后能够分别与底物中心杂环上的氨基氢和C2位取代基团上的酚基氢形成稳定氢键(图4B右上插入图)，对CTZ在催化腔中的固定起重要作用.

3.4 CTZ对nanoKAZ主链运动性的影响

分别对apo-nanoKAZ和nanoKAZ-CTZ中nanoKAZ蛋白主链原子的均方根涨落(root mean square fluctuation，RMSF)进行计算，分析CTZ对nanoKAZ分子的主链运动影响.

apo-nanoKAZ的分析结果显示除β4外，nanoKAZ中的其余10个β折叠均展现出较高的结构稳定性(RMSF值小于0.2 nm). 与之相对，α螺旋区域则展现出较高的主链运动性，具有代表性的是片段L18-F31与片段P61-H87，两片段在apo-nanoKAZ模拟中呈现多个大于0.25 nm的RMSF峰. 然而在nanoKAZ-CTZ复合体模拟中L18-F31与P61-H87的RMSF值却下降明显，特别是L18-F31内RMSF峰降幅高达0.2 nm以上，表明其运动性在底物进入空腔后受到抑制(图4C). 究其原因应该是片段L18-F31中残基L22，V27和F31与底物结合能量较高(超过-5 kJ/mol)且V27和底物CTZ形成了稳定氢键(图4B)，从而使该片段结构运动性显著降低. 另外，与L18-F31相连的Q32-P40片段在CTZ进入空腔后主链运动性增加，两相邻区段的主链运动性变化情况完全相反，暗示横跨这两个片段的α3(L30-L34)受到较大牵扯力作用，推测这可能是α3二级结构最终被破坏的主要原因(图4A，4C). 片段P61-H87运动性降低(图4C)的原因则应是因为该片段中心的F77与CTZ产生了较强结合能，导致周边区域稳定性提升所致(图4B).

图4 nanoKAZ-CTZ复合体内各氨基酸残基的结合能贡献情况与nanoKAZ的主链运动性间的关系A. 模拟开始前nanoKAZ的二级结构分布；B. nanoKAZ与CTZ的结合能分解图示：能量大于2 kJ/mol的氨基酸残基位点已被标出，其中与底物形成稳定氢键的两氨基酸残基Q12和V27下标“HB”，右方插入小图显示残基Q12和V27与CTZ间形成氢键随模拟时间的变化情况；C. apo-nanoKAZ与nanoKAZ-CTZ在200 ns动力学模拟期间氨基酸残基RMSF的叠合图谱. Fig. 4 The relationship between binding energy and backbone dynamics in the nanoKAZ-CTZ complex. A shows the secondary structure of nanoKAZ before simulation; B shows the binding energy contributes from all residues in the nanoKAZ-CTZ complex (residues contributing binding energy ≥2 kJ/mol are marked below, hydrogen bond forming residues Q12/V27 are further marked with “HB”), the inserted figure shows the hydrogen bond existence between Q12/V27 and CTZ during 200 ns simulation; C shows the overlapped residue RMSFs between nanoKAZ-CTZ and apo-nanoKAZ during 200 ns simulation.

nanoKAZ的分子结构显示片段L18-F31和片段P61-H87位于该蛋白中央疏水空腔的入口处. 在模拟过程中两片段由于与CTZ存在结合能作用，其自身以及周边片段均受到来自CTZ方向引力作用进而发生位移. 200 ns模拟完成后nanoKAZ-CTZ的构象显示，片段L18-F31的接邻片段V27-V38(含完整α3区域，其主链运动性受片段L18-F31影响)和片段P61-H87最终彼此靠拢并稳定，将nanoKAZ的疏水腔入口关闭形成完全闭合的疏水空间(图5).

图5 200 ns模拟前后nanoKAZ-CTZ(不显示CTZ结构)的结构叠合情况，其中片段V27-V38与片段P61-H87被标示并染色(模拟前两片段为红色，模拟后为青色)，方框内小图展示nanoKAZ在模拟前(A)与模拟后(B)内部疏水腔(透明淡蓝色显示)表面的变化情况(两图观察方向一致). Fig. 5 The superimposing of nanoKAZ-CTZ (CTZ removed) between those before and after 200 ns simulation. Fragments V27-V38 and P61-H87 are highlighted by cyan (before simulation) and red (after simulation), respectively. The inserted figures show the interior cavity (transparent light blue) of nanoKAZ between those before (A) and the after (B) 200 ns simulation in the same view direction.

此外，我们还发现nanoKAZ-CTZ复合体中三个片段较apo-nanoKAZ模拟时RMSD明显增加：G48-N50、V98-P104和Y109-R112. 其中，片段G48-N50和V98-P104位于两个短β转角结构上，距离底物较远，推测是底物的空间位阻对酶分子结构造成影响导致这两个片段不稳定性上升. 片段Y109-R112位于一个较长的β转角结构，在主链运动过程中，片段Y109-R112有几率与底物分子发生触碰；且nanoKAZ-CTZ的结合能分解结果显示残基Y109，F110和R112与底物存在结合能作用. 从空间位置上看，片段Y109-R112正对底物分子中心杂环C3位的酮基氧原子(图6)，有研究表明该原子为底物氧化反应的初始位点[8, 14]，据此推测片段Y109-R112有可能辅助或直接参与底物的氧化催化反应.

图6 模拟完成后CTZ(黄)与nanoKAZ形成的稳定复合体，与底物形成氢键的Q12和V27用绿色标示，片段Y109-R112用蓝色标示. Fig.6 The nanoKAZ-CTZ complex after 200 ns simulation. CTZ is colored yellow; residues Q12 and V27 that form hydrogen bonds with CTZ are colored green; the Y109-R112 loop with potential catalytic function is colored blue.

4 讨 论

基于以上结果，我们对nanoKAZ和CTZ结合形成复合体的过程做出以下推测：CTZ进入nanoKAZ空腔后，首先与位于β桶区域内7个氨基酸残基Q12，P40，I56，V58，L92，F151，C164发生作用，由于nanoKAZ的β折叠结构具有高稳定性，因此CTZ可以在其中调整取向并借由结合能稳定在催化空腔中. 同时，CTZ与片段L18-F31，P61-H87发生作用，导致α3结构被破坏形成loop区域同时两片段借与CTZ产生的结合能作用关闭nanoKAZ的催化腔形成完全的疏水空间. 由于底物CTZ具有高疏水特性，因而能够稳定于该腔中被催化氧化. 有研究报道nanoKAZ相较其他CTZ荧光素酶具有更高的底物类似物催化活性[8]，推测这是由于CTZ与nanoKAZ结合后，封闭催化腔的α3区域形变为loop具有一定柔性，有效抵消了底物类似物中改变基团在催化腔中的空间位阻，利于底物中心活性基团与nanoKAZ的催化位点接触.

另外，目前已有研究组通过定向进化实验对nanoKAZ上的部分氨基酸位点进行了突变研究，其结果显示改变位于催化腔关闭功能片段L18-F31，P61-H87上的氨基酸残基L18, S19, V27，S28，G67，G71，N85以及位于推测活性关联片段Y109-R112上的 R112能够大幅影响nanoKAZ的催化发光活性[15]，一定程度上支持了计算结果.

5 结 论

目前，以CTZ做为底物的酶催化发光反应机制大多处于未知状态，其主要原因是CTZ化学性质不稳定，在酶催化下反应极其迅速，难以对反应中间体进行分子结构测定. 本研究通过开展nanoKAZ与底物的分子对接及动力学模拟实验，揭示了CTZ在进入催化腔后分别与腔内β桶区域，腔口柔性片段作用最终封闭催化腔以促进催化反应发生这一过程. 另外，模拟结果还显示片段Y109-R112有可能参与催化反应. 该结果阐释了nanoKAZ与底物的结合模式，为以后nanoKAZ的理性分子改造提供了理论基础.