南亚热带不同树种人工林对土壤细菌群落多样性的影响

覃鑫浩，梁艳，陈超凡，覃林,3＊

(1.国家林业和草原局调查规划设计院，北京 100714；2.广西大学林学院，广西 南宁 530004；3.广西森林生态与保育重点实验室，广西 南宁 530004)

人工林是世界森林资源的重要组成部分，在木材供给、改善生态环境和应对气候变化等方面发挥重要作用。随着中国对木材需求日益增长及生态环境保护意识的不断提高，大规模的造林和再造林促使中国人工林面积继续保持世界首位[1-2]。我国南亚热带地区气候条件优越，是重要的商品用材林基地，多年来大面积多代连栽的马尾松（Pinus massonianaLamb.）、杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）等人工针叶纯林以及外来速生树种桉树（Eucalyptus）等短轮伐期工业用材林，为区域经济发展和农民脱贫致富做出了重大贡献；但这些人工纯林极易造成土壤肥力衰退、生物多样性下降及病虫害日益严重等生态环境问题[3-5]。因此，当前倡导并实施人工林生态系统适应性经营亟需解决的关键问题，是如何科学合理地营造和经营管理人工林，从而有效提高其生产力并维持多重生态服务功能。建立乡土阔叶人工林可以兼顾珍贵用材生产、生物多样性保护、生态功能和生态系统稳定性改善[1]。采用红锥（Castanopsis hystrixMiq.）、米老排（Mytilaria laosensisLec.）、火力楠（Michelia macclureiDandy）和山白兰（Paramichelia bailonii(Pierre) Hu）等不同生物学特性的乡土珍贵阔叶树种造林已成为我国亚热带地区人工林经营的发展趋势[6]。

细菌是土壤中数量最多、分布最广并参与土壤有机质分解和矿化过程的主要微生物，在土壤结构形成与土壤肥力调节等方面起极其重要作用[7]。土壤细菌群落多样性是评价土壤质量的重要指标之一，土壤中细菌群落多样性愈高，越有利于提高土壤恢复力与抗压力[8]。土壤细菌群落从土壤有机质的分解和矿化中获取能量，且土壤的碳、氮和磷供给对细菌多样性有显著影响[9-10]。树种可通过其凋落物和根系分泌物等影响土壤理化性质[11-13]，而土壤性质的改变会驱动土壤微生物群落组成和多样性的响应[14-15]。谭宏伟等[16]基于PCR-DGGE 技术比较分析了广西红壤区桉树人工林、马尾松人工林和天然阔叶林对土壤细菌群落多样性的影响，罗达等[17]运用磷脂脂肪酸法(PLFAs) 研究了我国南亚热带格木（Erythrophleum fordiiOliv.）、马尾松人工纯林及二者混交林林地土壤微生物生物量和群落结构特征，黄雪蔓等[18]采用磷脂脂肪酸法探究了固氮树种对第2 代桉树人工林土壤微生物生物量和结构的影响。然而，有关我国南亚热带地区不同造林树种，尤其是乡土树种与外来树种对林地土壤细菌群落多样性影响的比较研究甚少。

本文以位于广西凭祥市中国林业科学研究院热带林业实验中心的马尾松、红锥、米老排、火力楠和尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis）等不同树种人工林为研究对象，利用PCR-DGGE 技术分析不同树种人工林对土壤细菌群落多样性的影响，并探讨土壤细菌群落多样性与土壤理化性质因子之间的内在联系，旨在提高对人工林土壤细菌多样性变化规律的认识，以期为该地区倡导并实施人工林生态系统适应性经营策略的树种选择提供土壤微生物生态学方面的理论依据。

1 研究区及样地概况

1.1 研究区概况

研究区地处广西凭祥市中国林业科学研究院热带林业实验中心伏波试验场（106°51′～106°53′ E，22°02′～22°04′ N），该地区属于南亚热带季风区，为半湿润-湿润气候，干湿季节明显。年平均气温20.5～21.7℃，年平均降水量1 200～1 500 mm，年均蒸发量1 261～1 388 mm，空气相对湿度80%～84%。该地区地貌类型以低山丘陵为主，海拔430～680 m，土壤类型为红壤，土层厚度大于80 cm，pH 值为4.8～5.5[19]。

1.2 样地概况

2014年8月在研究区选取立地条件和经营措施相似的马尾松、红锥、米老排和火力楠等4种乡土树种人工林以及外来速生尾巨桉人工林为研究对象，其中，马尾松、红锥人工林于1983年营造，并分别于1993、1998、2009年进行了3 次间伐（强度约30%）；米老排、火力楠人工林在1981年种植，分别于1993年和2003年进行了2 次间伐（强度约30%）；尾巨桉人工林为2008年营造。上 述5种林分均是在杉木人工林皆伐迹地上营建，初植密度均为2 500株·hm−2。5种林分的平均树高、平均胸径、保留株数如下：马尾松林的分别为19.4 m、29.2 cm、1 470株·hm−2，红锥林的分别为17.1 m、23.4 cm、1 075株·hm−2，米老排林的分别为19.7 m、19.2 cm、1 208株·hm−2，火力楠林的分别为18.0 m、17.4 cm、1 225株·hm−2，桉树林的分别为16.9 m、11.1 cm、2 300株·hm−2。

2 研究方法

2.1 土壤样品采集

在5种人工林中按上、中、下坡位各设置1个20 m×20 m 的样地，并进行林分调查。在每个样地内的对角线上随机选取3个土壤采集点，挖取0～20 cm 土层土壤剖面，将3个取样点土壤充分混合形成一个土壤样品，然后将这个土壤样品分成3 份。一份装入铝盒用于测定土壤含水量；另一份装入布袋用于测定土壤化学性质；第三份装入聚乙烯保鲜袋并用生物冰袋保存带回实验室，挑出土壤样品中大的石砾、植物根系等杂物后过2 mm筛，放入−80℃超低温冰箱保存用于土壤细菌多样性测定。

2.2 土壤理化性质的测定

土壤含水量（SWC）采用烘干法测定，pH 值采用电位法测定（水:土为2.5:1）（Prtavo 907 MULTI pH，德国），土壤总碳（TC）含量采用Multi N/C 3100 TOC 分析仪（Analytik Jena，德国）测定，全氮（TN）含量采用H2SO4-HClO4消解后用SmartChem200 全自动化学元素分析仪（Alliance，法国）测定，土壤硝态氮（NO3−-N）和铵态氮（NH4+-N）含量采用SmartChem200 全自动分析仪（Alliance，法国）测定，土壤全磷（TP）含量采用酸溶-钼锑抗比色法测定，有效磷（AP）含量采用盐酸-氟化铵法测定，全钾（TK）含量采用氢氧化钠碱熔-火焰光度法测定，速效钾（AK）含量采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定[20]。土壤有效氮（AN）含量为硝态氮和铵态氮含量总和。

2.3 土壤微生物基因组DNA 提取、PCR 扩增和DGGE 分析

将新鲜土壤样本采用PowerSoil®DNA Isolation Kit 试剂盒（MoBio，USA）进行基因组抽提，并取3 μL 基因组DNA 采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定基因组DNA 是否可用于后续实验。以提取的土壤微生物DNA 为模板，采用PCR 对土壤细菌16S rRNA V3 可变区进行扩增，其上游引物为357 F-GC（序列为CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG）和下游引物518 R（序列为ATTACCGCGGCTGCTGG）[16]。第1 次PCR 扩增体系为：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，引物上游和下游各1 μL，DNA模板1 μL，补ddH2O 至40 μL；其扩增程序为：94℃、2 min，然后94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，25个循环，最后72℃延伸5 min。将PCR 扩增产物采用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒回收。回收产物进行二次PCR 扩增。第2 次PCR 扩增体系为：BioLinker 2×Taq Mix 20 μL，引物上游和下游各2 μL，DNA模板4 μL，补ddH2O 至40 μL；扩增程序为：94℃、2 min，然后94℃、30 s，56℃、30 s，72℃、30 s，5个循环，最后72℃延伸5 min。PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析：采用Bio-Rad 公司DcodeTM的基因突变检测系统对PCR 反应产物进行分离。样品在变性剂浓度50%～75%（100% 的变性胶为7 mol·L−1的尿素和40% 的去离子甲酰胺的混合物）的8%丙烯酰胺凝胶中，在70 V 的恒定电压下，60℃电泳15.5 h。电泳完毕后，加入400 mL Biolinker DNA Red 染色液进行染色40 min 后置于Bio-Rad 凝胶成像系统中观察拍照。上述土壤细菌DNA 提取、PCR 扩增和DGGE分析由微基生物科技（上海）有限公司完成。

2.4 数据统计分析

采用Quantity One 分析软件（Bio-Rad）对各土壤样品的电泳条带数量进行统计分析，分别计算不同林分土壤细菌群落的丰富度（S）、Shannon指数（H）、Simpson 指数（D）和均匀度（EH）等多样性指数[21]。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）及Duncan 多重比较方法检测不同林分之间土壤理化性质参数、细菌群落多样性指数的差异显著性（p<0.05）。在分析前，对各变量指标进行正态分布（Shapire-Wilk test）及方差齐性检验（Levene test），若不满足则对数据进行Box-Cox 变换。采用Pearson 相关性分析土壤细菌群落多样性指数与土壤理化性质的相关性。上述计算由IBM SPSS 24.0 软件完成。

3 结果与分析

3.1 不同树种人工林的土壤理化性质

从表1 可知：5种人工林的土壤总碳含量差异不显著（p>0.05）；尾巨桉人工林的土壤含水量、pH、全钾和速效钾含量明显高于4种乡土树种人工林，但其土壤全磷和有效磷含量却低于4种乡土树种人工林；4种乡土树种人工林相比，马尾松林具有较低的土壤含水量、pH、全氮和有效磷含量，火力楠林却拥有较高的土壤全氮、全磷、全钾、有效氮和速效钾含量，红锥林的土壤全钾、有效氮和速效钾含量最低，而米老排林具有最高的土壤含水量。

表1 5种人工林土壤理化性质比较分析（n=3）Table 1 Comparative analysis of soil physicochemical properties among five different planted forests（n=3）.

3.2 土壤细菌群落的多样性

3.2.1 总DNA 提取和PCR 扩增检测 从5种人工林土壤样品提取的微生物基因组总DNA 中各取3 μL用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，其结果（图1a）显示：DNA Marker 条带亮度较好，且无明显拖带现象，可用于后续实验。从土壤细菌16S rRNA 的V3 可变区第2 次PCR 扩增产物各取4 μL 于1%琼脂糖凝胶电泳检测结果（图1b）可知：PCR 扩增后的DNA 片段长度在250 bp 左右，且无杂带，说明提取的DNA 方法适合PCR 扩增，可以直接进行后续实验。

图1 5种林分土壤细菌总DNA 的琼脂糖电泳图谱（a）和土壤细菌16S rRNA 基因V3 区的第2 次PCR 扩增片段图谱（b）Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total DNA extracted from the soil bacteria(a) and the PCR amplified fragment 16S rRNA (V3) gene of the soil bacteria (b) collected from the five different tree species plantations

3.2.2 土壤细菌群落DGGE 图谱分析运用DGGE 技术将各土壤样品中细菌的16S rRNA 基因V3 片段PCR 产物分离出数目不等的电泳条带（图2a），经过Quantity One 软件将原DGGE 胶图转换成直观的条带分布图（图2b）。在图2b中，位于同一水平线的为相同物种，而左右两侧的数字为经分析后该板胶共有的条带数（也可认为是该板胶上所有样本包含的物种数），最下面一行的百分数是以第1个样本为基准的前提下，其余样本与第1 样本的相似性。根据DGGE 技术可以将长度相同而序列不同的DNA 分离的原理，DGGE 胶中条带数量越多，说明微生物种类丰富度越高[22]。5种林分土壤细菌DGGE 图谱的条带数量顺序为：米老排林（45.67） >红锥林（45.33） >马尾松林（43.00） >火力楠林（40.67） >尾巨桉林（40.00）（表2）。

图2 不同林分土壤细菌群落的DGGE 胶图（a）和条带分布图(b)Fig.2 The DGGE profile (a) and strip distribution (b) of soil bacterial communities in different planted forests

3.2.3 土壤细菌群落多样性 根据16S rRNA 的PCR-DGGE 图谱中条带的位置和亮度的数值化结果，计算各林分土壤细菌群落的丰富度、Shannon指数、Simpson 指数和均匀度（表2）。由表2 可知：各多样性指数在5种林分间的差异不显著（p>0.05），但尾巨桉林土壤细菌群落的各多样性指数均略低于4种乡土树种人工林。

表2 不同林分土壤细菌群落多样性比较（n=3）Table 2 Comparison of soil bacterial community diversity for different studied plantations（n=3）

3.3 土壤细菌群落多样性和土壤理化性质的相关性

土壤样品的细菌群落多样性指标与土壤理化性质参数的Pearson 相关分析（表3）表明：5种林分土壤细菌群落的Shannon 指数、Simpson 指数和均匀度与土壤全氮显著正相关（p<0.05），而其Simpson 指数和均匀度与土壤全磷显著正相关（p<0.05）。

表3 土壤细菌群落多样性指数与土壤理化性质的Pearson 相关系数Table 3 Pearson correlation coefficient between diversity indices of soil bacterial community and soil physicochemical properties

4 讨论

在我国南亚热带地区，将针叶或外来速生树种人工林转变为乡土阔叶树种后其人工林生态系统功能的变化已引起生态学者关注[4,23]。本文利用PCRDGGE 技术，探讨马尾松、红锥、米老排和火力楠等4种乡土树种人工林及外来树种尾巨桉人工林对林地土壤（0～20 cm）细菌群落多样性的影响，结果表明，尾巨桉林土壤细菌群落的丰富度、Shannon指数、Simpson 指数和均匀度与4种乡土树种人工林之间的差异不显著（p>0.05），这与谭宏伟等[16]关于广西红壤区桉树人工林土壤细菌丰富度、多样性指数以及均匀度皆与乡土树种马尾松人工林之间无显著差异的结论基本一致。

不同的植物凋落物数量和质量以及根系分泌物化学特性的不同必然引起土壤理化性质的变化，进而引起土壤微生物群落结构及多样性的改变[24-25]。土壤氮素是土壤细菌的重要营养来源，而土壤中的全氮是衡量土壤氮素供应状况的重要指标[26]。白晓旭等[27]研究认为，全氮是影响河南宝天曼自然保护区不同林龄锐齿栎（Quercus alienaBl.var.acuteserrataMaxim.ex Wenz）及不同林分类型（短柄枹（Quercus glanduliferavar.brevipetiolataNakai）林、栓皮栎（Quercus variabilisBl.）林、锐齿栎/华山松（Pinus armandiiFranch.）混交林和80年生锐齿栎林）土壤细菌群结构变化的重要因子，且随全氮含量的增加，土壤菌群物种多样性呈增加趋势；朱平等[28]发现，祁连山不同植被类型（垫状植被、高寒草甸、沼泽化草甸和高寒灌丛）土壤微生物群落多样性与全氮显著正相关（p<0.05）。本研究中，5种人工林土壤细菌多样性与土壤全氮显著正相关（p<0.05），与上述研究结果基本一致。此外，土壤中磷素也是土壤细菌的重要营养来源，但是土壤中的磷素大部分以迟效性状态存在，全磷含量高并不意味着磷素供给充足，而全磷含量低于某一水平时却可能意味着磷素供应不足[29]。我国土壤全磷含量为0.2～1.1 g·kg−1，若全磷含量低于0.4 g·kg−1则有可能磷供应不足[20]。本研究中，5种人工林土壤全磷含量（0.12～0.30 g·kg−1）低于0.4 g·kg−1，导致土壤全磷成为细菌在土壤中生存和繁殖的影响因子，这可能是5种林分土壤细菌群落多样性与土壤全磷显著正相关的缘故。

在森林生态系统中，由于水分、养分、通气、温度、pH 值等因子在土壤剖面上存在差异，导致土壤细菌多样性也存在某种程度上的差别[30-31]。张社奇等[32]在研究黄土高原刺槐（Robinia pseudoacaciaLinn.）林地土壤微生物垂直分布时发现，土壤深度对细菌数量的分布具有显著影响；杜璨等[33]探讨了红桦（Betula albosinensisBurk.）林4个土壤层（0～10、10～20、20～40、40～60 cm）细菌群落丰富度、多样性指数和细菌群落组成及丰度变化；彭雯等[6]指出，不同土层（0～20、20～40 cm）在门、纲、目分类水平上均表现出桉树林土壤细菌群落组成与其他5种乡土树种（红锥、米老排、火力楠、山白兰和马尾松）人工林存在明显差异。然而，本文仅讨论了南亚热带5种不同树种人工林对0～20 cm 土层细菌群落的丰富度、Shannon 指数、Simpson 指数和均匀度的影响，那么这5种人工林之间土壤细菌群落多样性的差异是否依土层不同而不同？还有待进一步研究。另外，我国南亚热带地区气候干湿季分明（4—9月为湿季，10月至翌年3月为干季），而不同季节会对植被土壤微生物群落多样性产生影响[28,34-35]。因此，本文研究的5种人工林对土壤细菌群落多样性的影响是否会因季节而异，还需深入探究。

5 结论

南亚热带地区的马尾松、红锥、米老排、火力楠和尾巨桉等人工林在0～20 cm 土层间土壤细菌群落多样性无显著差异，5种人工林土壤细菌群落多样性与土壤全氮和全磷显著正相关。说明乡土阔叶树种（红锥、米老排和火力楠）人工林对表层土壤细菌群落多样性的影响效果与乡土针叶马尾松人工林及外来尾巨桉人工林相似。因此，在该地区营建乡土树种人工林与外来按树人工林对土壤细菌群落多样性的影响效果无明显差异。