风湿关节炎片的质量标准提升研究△

刘东升，刘婷婷，姚世霞，朱旭江*，张明童*，朱琳，苏蕊

1.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州 730070；

2.国家药品监督管理局 中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃 兰州 730070

风湿关节炎片是由制马钱子（调制粉）、麻黄、当归、续断、桃仁、红花等17 味中药制成的中药制剂，具有祛风燥湿、活血止痛的功效，临床上用于治疗腰腿疼痛、风湿痹痛、风湿性关节炎等证。处方中马钱子为调制粉入药，占处方总量的28%，其有效成分为马钱子碱和士的宁，两者都是毒性成分。其中，士的宁毒性较强，且治疗剂量和中毒剂量接近[1]，士的宁对中枢神经系统的毒性较大，成人口服5～10 mg 就会出现中毒症状[2-6]。马钱子碱用于毒杀啮齿类动物和其他害虫，可阻断神经肌肉传导，呈现箭毒性[6-8]。风湿关节炎片现行标准为《卫生部药品标准·中药成方制剂》第三册，标准中仅有性状和常规检查项，缺少专属性指标成分的定性鉴别和定量测定方法，无法实现标准可控和质量安全有效的目标。

本研究结合文献报道的风湿关节炎片质量评价方法[9-16]和《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）马钱子、麻黄和当归质量标准项下的有关方法[17-19]，采用麻黄、当归对照药材和马钱子碱、士的宁对照品为指标性成分，分别建立了相应的定性和定量检测方法；并分别采用马钱子总生物碱对照提取物和马钱子碱、士的宁对照品测定样品含量，探讨马钱子总生物碱对照提取物代替马钱子碱、士的宁对照品的可行性；完善了风湿关节炎片的质量标准，为提高其质量控制方法提供了实验数据，对保证其质量具有重要意义。

1 材料

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪（沃特世公司）；LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；ME204 型分析天平（梅特勒-托利多公司）；SAMPLER4 型薄层色谱点样仪（卡玛公司）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品盐酸麻黄碱（批号：171241-201508，纯度：99.8%）、马钱子碱（批号：110706-200505，纯度：97%）、士的宁（批号：110705-200306，纯度：95.9%），马钱子总生物碱对照提取物（批号：112030-201601，含 马 钱 子 碱45.4%，士 的 宁49.9%）、麻黄对照药材（批号：121051-201606）、当归对照药材（批号：120927-201516）均购于中国食品药品检定研究院；试剂均为色谱纯；水为超纯水。

马钱子（调制粉）、麻黄、当归、苍术、续断、桃仁、红花、乳香（制）、没药（制）、千年健、地枫皮、羌活、地龙、桂枝、穿山甲（制）、木瓜、牛膝经甘肃省药品检验研究院中藏药室马潇主任中药师鉴定为正品，均符合《中国药典》2020 年版（一部）项下规定。

风湿关节炎片为A（批号分别为20170201、20170202、20170203、20170301、20170401、0170402）、B（批号分别为20141101、20131102）、C（批号：20141001）和D（批号：20140101）4 家生产企业共10批样品。

2 方法与结果

2.1 麻黄的薄层色谱法（TLC）鉴别

取本品3 g，研细，分别加三氯甲烷20 mL，浓氨试液1 mL，振摇1 h，取离心后的上清液加盐酸溶液（3→10）5 mL，振摇混匀，蒸干上层液，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取麻黄对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取盐酸麻黄碱对照品，加三氯甲烷制成质量浓度为2 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。按处方比例及制备工艺，制备缺麻黄的阴性样品，同供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。依据《中国药典》2020 年版（四部）TLC[20]试验，分别吸取供试品及阴性样品溶液各10 μL，其余各3 μL，点于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（40∶10∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，加热至斑点显色清晰，日光下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应位置上，均出现相同的特征斑点，且阴性对照无干扰，见图1。

图1 麻黄TLC图

2.2 当归的TLC鉴别

取本品约2.4 g，研细，加乙醚40 mL，加热回流1 h，挥干乙醚液，残渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取当归对照药材1 g 和阴性样品2.4 g（按处方比例及制备工艺，制备缺当归的阴性样品）照供试品溶液的制备方法，同法分别制成对照药材溶液和阴性样品溶液。依据《中国药典》2020 年版（四部）TLC[20]试验，分别吸取阴性和供试品溶液各10 μL，对照药材溶液3 μL，点于同一硅胶G 板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，均出现相同的特征斑点，且阴性样品无干扰，见图2。

图2 当归TLC图

2.3 马钱子含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适用性试验 色谱柱为CAPCELL PAK C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠与0.01 mol·L-1磷酸二氢钾等量混合溶液（用磷酸调pH 2.8）（B），梯度洗脱（0～45 min，17%～20%A）；检测波长为260 nm；流速：1.0 mL·min-1；进样量10 μL；柱温30 ℃。在上述条件下，阴性样品、对照、马钱子总生物碱对照提取物及样品的HPLC 图见图3。

图3 风湿关节炎片专属性HPLC图

2.3.2 溶液的制备 对照提取物溶液：精密称取马钱子总生物碱对照提取物23.60 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻线，摇匀，即得。

对照品溶液：分别精密称取马钱子碱和士的宁对照品12.81、16.02 mg 于100 mL 的量瓶中，加甲醇至刻线，摇匀，即得。

供试品溶液：取本品15 片，除去包衣，研细，取粉末约2 g，精密称定，置锥形瓶中，滴加5%氢氧化钠溶液约8 mL，混匀，超声处理（250 W，50 kHz）2 min。精密加入三氯甲烷25 mL，称定质量，置于70 ℃水浴加热回流2 h，取出，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失质量，充分振摇，滤过，精密吸取续滤液5 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性样品溶液：按处方比例及制备工艺，制备缺马钱子的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成不含马钱子碱和士的宁的阴性样品溶液。

2.3.3 线性关系考察 取马钱子总生物碱对照提取物溶液（马钱子碱质量浓度为0.106 2 mg·mL-1，士的宁质量浓度为0.117 8 mg·mL-1）和对照品溶液（马钱子碱质量浓度为0.098 86 mg·mL-1，士的宁质量浓度为0.124 30 mg·mL-1），按2.3.1 项下色谱条件分别进样0.5、3.0、5.0、8.0、10.0、15.0 μL。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积A 为纵坐标（Y），进行回归分析。

对照提取物：马钱子碱及士的宁回归方程分别为Y=1 841 826.94X-40 431.31（r=0.999 9）；Y=1 995 338.32X-50 076.73（r=0.999 9），表明马钱子碱和士的宁分别在0.005 310～0.159 300、0.005 890～0.176 650 μg·mL-1线性关系良好。

对照品：马钱子碱及士的宁回归方程分别为Y=108 123.41X-291.24（r=0.999 9）；Y=139 697.79X-171.65（r=0.999 9），表明马钱子碱和士的宁分别在0.004 913～0.147 410、0.006 215～0.186 450 μg·mL-1线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 取同一批号（批号：20170201）的供试品溶液，按2.3.1 项下条件连续进样，结果马钱子碱和士的宁峰面积的RSD 分别为0.53%、1.21%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号：20170201），在室温下放置0、6、12、16、20、24 h后分别进样，测定待测成分峰面积积分值。结果马钱子碱和士的宁峰面积的RSD 分别为1.26%、2.53%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 精密称取同一批（批号：20170201）的供试品6 份，平行测定峰面积积分值，计算马钱子碱和士的宁含量的RSD 分别为2.12%、1.61%，表明本方法的重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 分别精密吸取2.3.2 项下对照提取物溶液和对照品溶液2 mL，各平行6 份，置12 个具塞锥形瓶中，氮气吹干，再分别精密称取已知含量的同一批样品（批号：20170201）约1 g，加入上述锥形瓶中，按供试品溶液的制备方法同法处理，按2.3.1 项下色谱条件测定含量，计算加样回收率，结果马钱子碱平均回收率分别为103.20%、101.90%，RSD 分别为2.56%、1.85%；士的宁平均回收率为95.65%、97.27%，RSD 分别为1.90%、1.72%（表1），表明测定方法的回收率良好。

表1 风湿关节炎片中马钱子碱、士的宁含量测定的加样回收率试验

2.4 样品测定

按2.3.1 和2.3.2 项下方法测定10 批样品中马钱子碱和士的宁的含量，见表2。结果显示，马钱子总生物碱对照提取物和马钱子碱对照品测得样品中马钱子碱含量分别为0.018 8～0.748 1、0.012 6～0.731 5 mg/片；马钱子总生物碱对照提取物和士的宁对照品测得样品中士的宁含量分别为0.034 9～0.813 1、0.038 9～0.795 9 mg/片。

表2 不同生产厂家风湿关节炎片中马钱子碱和士的宁的含量测定mg/片

3 讨论

3.1 提取方法和时间考察

马钱子含量测定中，分别考察超声处理和加热回流2 种提取方法。精密称取样品6 份各约2 g，置锥形瓶中，滴加5%氢氧化钠溶液约4 mL，混匀，超声处理2 min 后，精密加入三氯甲烷25 mL，称定质量后，分别超声30、45、60 min或70 ℃水浴加热回流1、2、3 h 后分别测定马钱子碱和士的宁含量，结果发现，釆用加热回流提取效率更高、更完全，且70 ℃水浴加热回流2 h 时已基本提取完全，所以采用70 ℃水浴加热回流2 h的方法处理样品。

3.2 色谱条件的确定

取士的宁和马钱子碱对照品溶液，分别在190～400 nm 进行扫描，结果表明，士的宁在200.5、253.5 nm 均有吸收，马钱子碱在195.8、264.2、299.8 nm 处均有紫外吸收。结合《中国药典》2020年版（一部）马钱子项下士的宁和马钱子碱的测定方法，最后选定260 nm 为检测波长。且在此检测波长下对照品和样品都能得到较好的图谱。参考《中国药典》2020年版马钱子品种及有关文献[3,5,19]，考察以乙腈为流动相A，以0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠与0.01 mol·L-1磷酸二氢钾等量混合溶液（用磷酸调pH 2.8）为流动相B，进行等度和梯度洗脱。对测定结果进一步分析发现，当采用上述流动相进行梯度洗脱时，得到较好的峰形和分离度。

3.3 限度规定

处方中马钱子（调制粉）的量折算为55.9 mg/片，按此计算，士的宁应折算为0.642 9 mg/片（其中规定马钱子（调制粉）制法为取制马钱子，粉碎成细粉，照《中国药典》2020 年版（一部）马钱子〔含量测定〕项下的方法测定士的宁含量后，加适量淀粉，使其质量分数为1.15%，混匀，即得）。《中国药典》2020 年版（一部）马钱子药材士的宁质量分数为1.20%～2.20%，并结合士的宁的不良反应和日口服量（士的宁为马钱子的主要毒性成分，口服致死量为30 mg），暂定0.30～0.50 mg/片。风湿关节炎片口服量一次4 片，2 次/d。计算后1 d 口服马钱子中士的宁最大量为4.0 mg，远远低于口服致死量。参考《中国药典》2020 年版（一部）马钱子和马钱子粉项下含量，士的宁与马钱子最低含量比约为1.5。结合10 批样品中马钱子碱含量测定结果。暂时规定马钱子碱含量不低于0.30 mg/片。即本品每片含马钱子以马钱子碱（C23H26N2O4）计不得少于0.30 mg，以 士 的 宁（C21H22N2O2）计 应 为0.30～0.50 mg。待收集多批样品积累数据后再修订合适的含量限度。

4 结论

风湿关节炎片现行标准中仅有性状和常规检查项，不能有效控制药品质量，本研究依据《中国药典》2020 年版完善了风湿关节炎片的质量标准。根据《中国药典》2020 年版（一部）药材项下相关方法并结合文献[6-11]，建立了麻黄和当归的薄层方法，得到的薄层色谱图斑点清晰，且阴性无干扰；参考《中国药典》2020 年版（一部）马钱子药材项下含量测定的方法及相关文献[7-8,19]，建立了风湿关节炎片中马钱子碱和士的宁的HPLC 含量测定方法。上述方法简便、准确、重复性好，可为风湿关节炎片质量控制提供参考。同时，本研究对采用马钱子碱、士的宁对照品与马钱子总生物碱对照提取物对测定风湿关节炎片中马钱子碱和士的宁的含量进行测定，通过SPSS 27 软件，采用独立样本非参数检验（Mann-Whitney U 秩和检验），对分别选用对照品与对照提取物作为对照后测定结果进行统计，结果表明，风湿关节炎片中马钱子碱和士的宁含量差异无统计学意义。考虑到马钱子碱和士的宁为严格管控的剧毒化学品，且单体对照的纯度非常高，存在安全隐患，而马钱子总生物碱对照提取物纯度较低、安全性好、成本较低，更易获得[4]。因此，马钱子总生物碱对照提取物代替马钱子碱、士的宁单体对照有较强的可行性。