基于HPLC-LTQ-Orbitraps-MSn分析比较酸枣仁-五味子药对单煎液和合煎液化学成分△

王晓玫，刘洁，2，丁永胜，3，罗静，4，赵程博文，5，姚子蔚，李秋雨，3，刘金凤，于佳禾，魏晓嘉，李佳园，万国慧，金重先，王雨青，杨雪，吕研，边丽华，王春国*，石晋丽*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.首都儿科研究所 附属儿童医院，北京 100020；

3.华润双鹤药业股份有限公司，北京 100102；

4.重庆药友制药，重庆 401121；

5.北京中医药大学 东直门医院，北京100700

酸枣仁来源于鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 的干燥成熟种子[1]382-384，主要含三萜（含三萜皂苷）、黄酮、生物碱等成分。五味子来源于为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实[1]68，主要含木脂素、挥发油、降三萜等成分。基于脱胎于《神农本草经》的药对理论的指导，两者配伍可全方位补心气、安心神[2]，常联合应用治疗失眠、健忘、焦虑等临床疾病，酸枣仁-五味子配伍比例以1∶1 和2∶1 为主[3]。本课题组前期研究发现，炒酸枣仁-醋五味子2∶1配伍时，具有显著的抗焦虑作用[4]。有研究者采用超高效液相色谱法（UPLC）和高效液相色谱法（HPLC）对酸枣仁-五味子1∶1配伍药对进行指纹图谱分析和含量测定[5-6]，发现配伍后斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素5 个成分的溶出均降低，认为与煎煮过程中的大量沉淀有关[5]。早在2009 年，王卫记等[7]运用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC-ESI-MSn）技术，从酸枣仁有效部位中鉴定出13 个化合物；2018 年，毛怡宁等[8]通过超高效液相色谱-线性离子阱串联静电场轨道阱联用质谱法（UHPLC-LTQ-Orbitrap-MS）技术，从酸枣仁中鉴定、推断出24 个化合物和4 个未知化合物；夏丽文等[9]应用超高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱（UPLC-ESI-TOF/MS）技术在五味子中表征出24 个峰并初步鉴定了17个峰。目前，尚未见酸枣仁-五味子2∶1 配伍前后化学成分变化的报道。本研究利用HPLC-LTQ-Orbitraps-MSn技术对该药对2∶1配伍前后的化学成分进行分析、比较，为进一步研究两者配伍作用机制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Accela 600 pump 型高效液相色谱仪、LTQOrbitrap XL 型质谱仪，配有加热电喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 2.1 化学工作站（美国Thermo Scientific 公司）；R200D 型分析天平（十万分之一，德国Satorius公司）。

1.2 试药

对照品芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707，纯度≥98%）；五味子醇乙（上海源叶生物科技有限公司，批号：P14N10F103016，纯度≥98%）；五味子酯甲（四川维克奇生物科技有限公司，批号：wkq16050901，纯度≥98%）；乙醇（北京化工厂，分析纯）；娃哈哈矿泉水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈（赛默飞世尔科技有限公司，质谱纯）。

炒酸枣仁（批号：20150601）购于四川禾一天然药业有限公司，醋五味子（批号：20160122）购于吉林省元力药业有限公司，经北京中医药大学石晋丽教授鉴定，分别为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子，木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实。

2 方法

2.1 分析样品制备

单煎液样品制备：精密称取炒酸枣仁30.03 g、醋五味子30.02 g，分别置于500 mL 圆底烧瓶中，2 个样品均加8 倍量80%乙醇浸泡30 min，加热回流1 h，滤过；滤液备用，滤渣加10 倍量纯水，加热回流提取1 h，滤过，合并2次滤液，浓缩并用甲醇定容于25 mL量瓶中，得酸枣仁单煎液样品、五味子单煎液样品。

合煎液样品制备：精密称取炒酸枣仁20.01 g，醋五味子10.00 g，制法同上。以上样品分别过0.45 μm微孔滤膜于液相进样瓶中备用。

2.2 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，2%～3%A；5～8 min，3%～9%A；8～30 min，9%～11%A；30～32 min，11%～18%A；32～52 min，18%～19%A；52～67 min，19%～25%A；67～74 min，25%～43%A；74～78 min，43%～52%A；78～89 min，52%～55%A；89～114 min，55%～95%A）；流速为0.4 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为210 nm；进样量为4 μL。

2.3 质谱条件

HESI源电压（正离子模式3.0 kV，负离子模式4.0 kV）；干燥气流速：15 L·min-1，干燥气体温度（正离子模式300 ℃，负离子模式350 ℃）；毛细管温度：250～350 ℃；碰撞电压：6～10 V；扫描范围：m/z100～1500。采用傅里叶变换高分辨全扫方式（TF，Full scan，Resolution 30 000) 和数据依赖性（data-dependent acquisistion）ddMS2和ddMS3方法获取各级质谱碎片。

3 结果

3.1 配伍前后整体分析

酸枣仁、五味子药对（2∶1）单煎液、合煎液在正、负离子模式下的总离子流图（TIC）见图1～6。

图2 酸枣仁单煎液负离子模式TIC及UV 254 nm响应

图3 五味子单煎液正离子模式TIC及UV 254 nm响应

图4 五味子单煎液负离子模式TIC及UV 254 nm响应

图5 酸枣仁-五味子（2∶1）合煎液正离子模式TIC及UV 254 nm响应

图6 酸枣仁-五味子（2∶1）合煎液负离子模式TIC及UV 254 nm响应

根据保留时间信息、高分辨质谱精确相对分子质量和多级碎片信息，与已报道的相关化合物碎片进行比对分析，在酸枣仁单煎液正、负离子模式下共对50 个色谱信号进行化学成分鉴定，指认出其中10 个（黄酮类6 个、生物碱2 个、皂苷2 个）近10 年报道过指纹图谱分析或含量测定的化合物，并发现8 个黄酮类化合物在正、负离子模式下均可检出；在五味子单煎液正、负离子模式下共对32 个色谱信号进行化学成分鉴定，指认出10个近10年报道过指纹图谱分析或含量测定的成分（均为木脂素类）；在酸枣仁-五味子药对（2∶1）合煎液正、负离子模式下共对50 个色谱信号进行化学成分鉴定，指认出19个近10年报道过指纹图谱分析或含量测定的成分（黄酮类5 个、生物碱1 个、皂苷1 个、木脂素类12 个），这些成分在各自单煎液中均已被指认。合煎液未检出单煎液中可检出的1 个酸枣仁皂苷（酸枣仁皂苷B）和1 个具有同分异构体的酸枣仁生物碱（酸李碱或木兰花碱）。酸枣仁与五味子单煎液中指认出的共计21 个成分，除去前述的酸枣仁皂苷B、酸李碱或木兰花碱，即为本研究在合煎液中指认出的19 个成分。在检出成分个数略有减少的同时，合煎液中检出了1 个来自五味子的同分异构体离子峰，该峰在单煎液中未检出，笔者认为这是值得注意的。

来源于酸枣仁或五味子的近10 年报道过指纹图谱分析或含量测定的化合物，在酸枣仁单煎液中指认出的10个，分别为文赛宁-Ⅱ[10-11]、6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素[10-11]、6‴-阿魏酰斯皮诺素[10-11]、6‴-对香豆酰斯皮诺素[10]、芦丁[12]、斯皮诺素[7-8]（以上6 个为黄酮类）、酸李碱[13]、木兰花碱[14]（以上2 个为生物碱）、酸枣仁皂苷A[15-16]、酸枣仁皂苷B[15-16]（以上2 个为皂苷）；在五味子单煎液中指认出的10个木脂素类成分为五味子醇甲[17]、五味子醇乙[17]、五味子酯甲[17]、五味子甲素[17]、五味子乙素[17]、五味子丙素[17]、五味子酚[18]、五味子酯乙[18]、戈米辛D[19]和戈米辛J[19]。酸枣仁单煎液正、负离子模式下均可检出的8个化合物是异牡荆素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、当药黄素、6‴-香草酰斯皮诺素、6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素、异牡荆素-2″-O-6-阿魏酰-葡萄糖苷、6‴-芥子酰斯皮诺素、6‴-对香豆酰斯皮诺素、6‴-（-）-phaseoylspinosin，其中，当药黄素和6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素在合煎液正、负离子模式下均可检出，6‴-香草酰斯皮诺素、6‴-对香豆酰斯皮诺素仅在合煎液负离子模式下可见检出，6‴-（-）-phaseoylspinosin和异牡荆素-2″-O-6-阿魏酰葡萄糖苷在合煎液中未检出。

酸枣仁、五味子单煎液与合煎液的共有成分和特有成分种类见图7（所有在同一样品的正、负离子模式下均可检出的化合物在该样品中仅保留1 次）。由图7 可见，酸枣仁单煎液中1/2 的色谱信息和五味子单煎液中大部分的色谱信息在合煎液中也存在，合煎液中存在2 个特有成分，为戈米辛L1/L2/M1/M2信号3和9，12-亚油酸同分异构体信号2；其中戈米辛L1/L2/M1/M2信号3 有较大研究意义，表明合煎液中新增了五味子木脂素离子峰。

图7 酸枣仁、五味子单煎液与合煎液（2∶1）韦恩图

3.2 酸枣仁单煎液分析

酸枣仁单煎液中鉴定出50 个色谱信号，除2 个有机酸及其糖苷类成分［24-羟基美洲茶酸、美洲茶酸（出现2 次）］、4 个生物碱类成分（乌药碱、酸李碱/木兰花碱、木兰花碱/酸李碱、6-葡萄糖-乌药碱）、5 个皂苷类成分（原酸枣仁皂苷A、原酸枣仁皂苷B、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、乙酰酸枣仁皂苷）外，其余成分均为黄酮类化合物。本研究对酸枣仁单煎液的鉴定结果见表1。以黄酮类成分为例进行分析。

表1 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的酸枣仁单煎液中化合物

续表1

续表1

酸枣仁中的黄酮类化合物大多为黄酮碳苷，在正离子模式下可少量检出；在负离子模式下，可较多检出，而且质谱裂解有较强的规律性，一般在与苷元直接相连的六碳糖上产生碎裂，脱去60（-CHO-CH2OH）、90（-CHOH-CHO-CH2OH）、120（-CHOH-CHOH-CHO-CH2OH）质量单位的碎片峰[8,23-24]，见图8[23]。

图8 黄酮C-糖苷糖环的裂解规律

如化合物7准分子离子峰为m/z593[M-H]-，二级质谱为m/z533[M-H-60]-，m/z503[M-H-90]-，m/z473[M-H-120]-，m/z413[M-H-120-60]-，m/z383[M-H-120-90]-，m/z353[M-H-120-120]-，2 次脱去60、90、120 质量单位的碎片离子，可以推断化合物7 为由2 个六碳糖分别与苷元直接相连的黄酮二碳苷。化合物12准分子离子峰为m/z593[M-H]-，二级质谱为m/z413[M-H-Glc-H2O]-，m/z353[M-H-Glc-H2O-60]-，m/z293[M-H-Glc-H2O-120]-，有规律地产生脱去60、90、120质量单位的碎片峰，基本可以判断为六碳糖的黄酮碳苷类化合物。化合物15 准分子离子峰为m/z607[M-H]-，二级质谱为m/z445[M-H-Glc]-，m/z427[M-H-Glc-H2O]-，m/z367[M-H-Glc-H2O-60]-，m/z337[M-H-Glc-H2O-90]-，m/z325[M-H-120-Glc]-，m/z307[M-H-Glc-H2O-120]-。化合物18 准分子离子峰为m/z455 [M-H]-，二级质谱为m/z385[M-H-60]-，m/z355[M-H-90]-，m/z325[M-H-120]-，m/z297[M-H-120-CO]-，m/z281 [M-H-120-CO-CH3]-，以上离子碎片符合当药黄素的裂解规律。化合物31准分子离子峰为m/z813 [M-H]-，二级质谱为m/z607 [M-Hsinapoyl]-，m/z427[M-H-sinapoyl-Glc-H2O]-，m/z337 [M-H-sinapoyl-Glc-H2O-90]-，m/z307[M-H-sinapoyl-Glc-H2O-120]-，以上离子碎片符合6‴-芥子酰斯皮诺素的裂解规律。结合文献[7,12,20]推测化合物7、12、15、18、31 分别为6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文赛宁-Ⅱ，维采宁）、异牡荆素-2″-O-吡喃葡萄糖苷、斯皮诺素、当药黄素、6‴-芥子酰斯皮诺素。化合物24、34、39、42一级质谱分别出现m/z942 [M-H]-，943 [M-H]-，711[M-H]-，1118[M-H]-，二级质谱均出现m/z607，445，427 等碎片离子，与斯皮诺素的质谱行为相似，提示其在C-6 处具有和斯皮诺素相同的结构骨架和2 个糖基团（葡萄糖），推测其为斯皮诺素类黄酮碳苷化合物[19-20]。6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文赛宁-Ⅱ，维采宁）可能的裂解途径见图9。

图9 6，8-二碳葡萄糖基芹菜素（文赛宁-Ⅱ，维采宁）可能的裂解途径

3.3 五味子单煎液分析

五味子单煎液中鉴定出32个色谱信号，除12个有机酸、内酯类成分（异柠檬酸、柠檬酸、披针叶五味子二内酯C同分异构体1～3、披针叶五味子二内酯C、9，12-亚油酸同分异构体1、α-亚麻酸或同分异构体信号1、α-亚麻酸或同分异构体信号2、内消旋二氢愈疮木酯酸、α-亚麻酸或同分异构体信号3、9，12-亚油酸）外，其余成分均为木脂素类化合物。本研究对五味子单煎液的鉴定结果见表2[9,25-41]。

表2 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的五味子单煎液中化合物

续表2

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以木脂素类成分为例进行分析。五味子木脂素类化合物须在正离子模式下检测。常丢失-CH3、-OCH3、-CH3OH、-C5H10、-C6H5COOH、-C2H4O、-CH2O等基团，生成相应的质谱碎片。其中化合物12和19的误差均介于-5～-10。五味子酯甲与戈米辛G 为同分异构体，具有相似的裂解途径（图10）。故将五味子醇乙、五味子酯甲和存在于酸枣仁等多种常见中药中的化合物芦丁配制成的混合对照品在正离子模式下进样分析（图11），确定其中m/z399（tR21.29，图11 中蓝色实线框所示）和m/z415（tR23.88，图11 中红色实线框所示）分别为此体系下五味子醇乙（C23H28O7）离子化并脱去1 H2O 和五味子酯甲（C30H32O9）离子化并脱去1 C7H6O2后形成的离子峰，结合参考文献[32,36]，确定化合物12为五味子醇乙，推测化合物19可能为五味子酯甲或戈米辛G。

图10 戈米辛G、五味子酯甲结构式及戈米辛G可能的裂解途径

图11 混合对照品在正离子模式下的TIC、UV（254 nm）响应及五味子醇乙（tR 21.29 min）、五味子酯甲（tR 23.88 min）MS一级碎片

3.4 酸枣仁-五味子合煎液（2∶1）分析

合煎液中鉴定出58个色谱信号，其中23个信号（因当药黄素和6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素在正、负离子模式下均可检出，实为21 个化合物）来自酸枣仁，约占酸枣仁单煎液中检出化合物的1/2；32个信号来自五味子，即五味子单煎液中的绝大部分化合物在合煎液中可检出。本研究对酸枣仁-五味子合煎液（2∶1）的鉴定结果见表3[7-8,12,20-42]。与五味子单煎液不同的是，合煎液比单煎液在C22H26O6同分异构体（m/z387.18）提取离子流图（EIC）tR48.52 min附近多出明显的离子流峰，一级质谱检出时间可认为在tR48.48 min（C22H26O6母离子误差为-2.170）。结合文献推测，合煎液中发生了来自五味子木脂素类化合物的转化[42]。三级离子的提取结果佐证了以上猜想（以387.18 为一级离子进行三级离子提取，结果显示,二级离子分别为m/z325.16、325.13、355.15、357.20 时可在五味子单煎液中提取到三级离子，二级离子分别为m/z325.13、325.22、355.21（2 次）、357.13 时可在酸枣仁-五味子（2∶1）合煎液中提取到三级碎片，即合煎液比单煎液在二级离子m/z355.21处多了1个三级离子的提取结果）。

3.5 酸枣仁-五味子合煎液（2∶1）分析

合煎液中鉴定出58个色谱信号，其中23个信号（因当药黄素和6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素在正、负离子模式下均可检出，实为21 个化合物）来自酸枣仁，约占酸枣仁单煎液中检出化合物的1/2；32个信号来自五味子，即五味子单煎液中的绝大部分化合物在合煎液中可检出。本研究对酸枣仁-五味子合煎液（2∶1）的鉴定结果见表3[7-8,12,20-42]。与五味子单煎液不同的是，合煎液比单煎液在C22H26O6同分异构体（m/z387.18）提取离子流图（EIC）tR48.52 min附近多出明显的离子流峰，一级质谱检出时间可认为在tR48.48 min（C22H26O6母离子误差为-2.170）。结合文献推测，合煎液中发生了来自五味子木脂素类化合物的转化[42]。三级离子的提取结果佐证了以上猜想（以387.18 为一级离子进行三级离子提取，结果显示，二级离子分别为m/z325.16、325.13、355.15、357.20 时可在五味子单煎液中提取到三级离子，二级离子分别为m/z325.13、325.22、355.21（2 次）、357.13 时可在酸枣仁-五味子（2∶1）合煎液中提取到三级碎片，即合煎液比单煎液在二级离子m/z355.21处多了1个三级离子的提取结果）。

表3 HPLC-LTQ-Orbitrap MSn分析的酸枣仁-五味子合煎液（2∶1）中化合物的质谱数据

续表3

续表3

4 讨论

一般而言，具有碱性基团的化合物适合质谱正离子模式分析，具有酸性基团的化合物适合质谱负离子模式分析[8]。酸枣仁、五味子中同时具有碱性和酸性基团，理论上在质谱正、负离子模式下均有响应值，故本实验分别选用正、负离子模式对酸枣仁单煎液、五味子单煎液、酸枣仁-五味子（2∶1）合煎液进行分析，较为全面地进行了以上三者的化学成分表征。酸枣仁单煎液中10 个曾做过含量测定的化合物中，只有2 个黄酮类成分（6‴-对羟基苯甲酰斯皮诺素、6‴-对香豆酰斯皮诺素）在正、负离子模式下可同时检出，其余4个黄酮类（文赛宁-Ⅱ、6‴-阿魏酰斯皮诺素、芦丁、斯皮诺素）、2 个生物碱（酸李碱、木兰花碱）、2个皂苷（酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B）成分仅在负离子模式下可检出，验证了负离子模式适宜分析酸枣仁中的化合物（黄酮和三萜皂苷类化合物均含有多个羟基等酸性基团，在负离子模式下，羟基易形成稳定的氧负离子[8]），对酸枣仁的化学成分研究结果进行了补充。

相关研究对酸枣仁-五味子药对1∶1配伍的单煎液、合煎液进行了UPLC指纹图谱分析和HPLC含量测定[5-6]，在酸枣仁单煎液指纹图谱中确定了11 个共有峰，在五味子单煎液指纹图谱中确定了10 个共有峰，在酸枣仁-五味子合煎液指纹图谱中确定了16个共有峰，并鉴定了其中的斯皮诺素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素5 个成分；发现与单煎液相比，除五味子甲素外，合煎液中的斯皮诺素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素的溶出成分峰面积均降低；酸枣仁皂苷A 与五味子醇甲的含量在合煎液中显著降低，与单煎液差异有统计学意义（P<0.01）；本研究在合煎液中酸枣仁皂苷B缺失的结果与之显示出一致趋势。

此外，本研究以80%乙醇和水各进行1 h加热回流提取，较全面地提取了其中的化合物；在此前提下，合煎液中鉴定出的酸枣仁化合物在数量上仅为单煎液中的1/2，五味子中的戈米辛R、戈米辛N、γ-五味子素（及1 个α-亚麻酸或其同分异构体的信号）在合煎液中缺失，进一步说明以上两药配伍煎煮时可能因各化学成分之间的反应，溶液pH 的变化，皂苷、鞣质等成分的影响，受热水解等过程的影响导致组分的溶出率降低[6]。不同的是，本研究通过合煎液中增加了1 个五味子木脂素离子峰的结果，推测合煎过程也可能增加化合物溶出或使化合物发生结构转化。

中医理论认为，酸枣仁与五味子同具酸味，均具有养心安神、收敛固涩之功效，符合“七情和合”的组合原理；两者配伍用量以酸枣仁为多，说明在此相须药对中，酸枣仁为君药，五味子为臣药[43]。本课题组前期实验研究表明，酸枣仁-五味子（2∶1）配伍时，具有显著的抗焦虑作用，其抗焦虑效果优于酸枣仁、五味子单独使用，两者的配伍作用机制尚不明确。利用高分辨质谱技术结合质谱结构解析软件，研究酸枣仁、五味子配伍前后化学成分的变化，为两者配伍前后在体内吸收、分布、代谢、排泄过程的研究提供参考，有助于阐明两者配伍作用机制，指导临床用药。