甘草地上部分寡糖富集纯化及其抗衰老活性研究△

于冰莉，方永晟，庞昕昕，郭小趁，王文全，2*，刘永刚*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193

人口老龄化已成为人们最关注的全球性社会问题之一，衰老及衰老相关疾病成为日益严重的医学问题和社会难题。氧化应激与衰老具有十分紧密的联系。关于衰老的经典学说氧化应激学说认为，衰老的根本原因是氧化性损伤，即自由基积累造成的细胞损伤[1]。通过抗氧化活性药物降低体内自由基水平是延缓机体衰老的重要途径之一。

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflataBat.或光果甘草G.glabraL.的干燥根和根茎[2]，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药之功效[3]。我国有“十方九草”“无草不成方”之说，从古至今，甘草根及根茎广为药用，而其地上部分常作为牧草或是焚烧丢弃，造成资源浪费。研究发现，甘草地上部分提取物具有抗氧化[4-9]、抗炎[9-10]、抑菌[11-14]、抗肿瘤[15]等多种药理活性。甘草地上部分水提物中多糖类成分已有报道，且抗氧化活性良好[6]。从中药提取出的寡糖活性成分有很多，如巴戟天寡糖可能通过抗氧化减轻子宫缺血再灌注损伤[16]；人参花寡糖可恢复D-半乳糖诱导的氧化损伤，提高氧化酶活力，减少丙二醛（MDA）在体内的积累[17]。而甘草地上部分寡糖的研究尚未见相关报道。

本研究对甘草地上部分进行提取，运用柱色谱技术分离纯化水提物得到寡糖类成分，借助凝胶渗透色谱、薄层色谱手段对其进行表征，通过体内、体外实验评价甘草地上部分寡糖的抗衰老、抗氧化活性，探索其中潜在抗衰老天然活性物质，为后续甘草地上部分资源综合开发利用提供参考。

1 材料

1.1 菌株、线虫品系

大肠杆菌Escherichia coliOP50、野生型秀丽隐杆线虫株N2由中国科学院遗传与发育生物学研究所惠赠。

1.2 试药

甘草地上部分，2018 年9 月采集于甘肃省酒泉市瓜州县河东乡，经中国医学科学院药用植物研究所王文全教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的地上部分，阴干，粉碎，备用。

无水乙醇、甲醇、乙酸乙酯均为分析纯（天津市致远化学试剂有限公司）；吡啶、苯胺、磷酸、丙酮、硫酸、二苯胺、硝酸钠、氯化钠均为分析纯（北京化工厂）；5%苯酚水溶液（上海源叶生物科技有限公司）；对照品D-葡萄糖（纯度≥99%，批号：S21J12I138537）、D-果糖（纯度≥99%，批号：J31M9R62568）、维生素C（纯度≥98%，批号：S19J6G1），均购自上海源叶生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[DPPH，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；葡聚糖相对分子质量标准物质[重均相对分子质量（Mw）分别为289 000、110 000、60 600、12 600、4320，批号分别为C10025642、C10025640、C10034456、C10020386、C10020398]，购自上海麦克林生化科技有限公司；AB-8 型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；DEAE-52 型纤维素树脂（北京索莱宝科技有限公司）；Sephadex LH-20型树脂[安玛西亚（中国）有限公司]；薄层色谱硅胶G板（青岛海洋化工有限公司）。

1.3 仪器

CP224C型万分之一分析天平（奥豪斯上海仪器有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪（赛默飞世尔科技有限公司）；BKQP-75L 型立式高压灭菌锅（济南博鑫生物技术有限公司）；UV-2600 型紫外-可见分光光度计（尤尼柯上海仪器有限公司）；SMZ745 型体视显微镜、ECLIPSE Ts2R 型荧光倒置显微镜（尼康映像仪器销售中国有限公司）；e2695型色谱仪[色谱柱为Ultrahydrogel TM 250（300 mm×7.8 mm，6 μm）与Ultrahydrogel TM Linear（300 mm×7.8 mm，10 μm）串联]、2424 RI Detector型示差折光检测器均购于沃特世科技有限公司。

2 方法

2.1 苯酚-硫酸法测总糖含量

2.1.1 葡萄糖标准曲线绘制 精密称取对照品D-葡萄糖10 mg，加去离子水定容于100 mL量瓶中，混匀，即得葡萄糖对照品溶液，质量浓度为0.10 mg·mL-1。精密移取葡萄糖对照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 于10 mL 量瓶中，加入去离子水补至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，加入浓硫酸5 mL，振摇混匀，室温条件下静置20 min，冰浴15 min，在波长487 nm 处测定其吸光度（A）值。以A为纵坐标，对照品溶液质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程。

2.1.2 样品溶液总糖含量测定 精密称取受试样品10 mg，用去离子水定容于10 mL 量瓶中，混匀。精密移取样品溶液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，加入去离子水补至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，再加入浓硫酸5 mL，振摇混匀，室温条件下静置20 min，冰浴15 min，在波长487 nm处测定其A值，将A值代入回归方程计算得到其总糖含量。

2.2 甘草地上部分寡糖的制备

取甘草地上部分，加10 倍量去离子水，加热提取2 次，每次连续回流2 h，纱布滤过，合并滤液，旋蒸浓缩，真空干燥后得到水提物。

取水提物，溶于少量水中，过AB-8型大孔树脂柱[18]，径高比1∶8，吸附过夜，先以4 倍柱体积（BV）水洗除杂，再以30%乙醇洗脱，洗脱流速为3 BV·h-1，洗脱体积为8 BV，得到粗糖富集物。

取粗糖富集物，上样DEAE-52 纤维素柱[19]，依次以去离子水及0.1、0.3、0.5 mol·L-1NaCl梯度洗脱，洗脱体积为4 BV，流速为1 mL·min-1，洗脱液每5 mL接1瓶，以洗脱体积为横坐标，以苯酚-硫酸法测得总糖含量为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并糖含量高的洗脱液，透析、浓缩、干燥，得到粗糖。

取粗糖，溶于少量甲醇中，上样Sephadex LH-20 凝胶柱[20]，甲醇洗脱，洗脱体积为5 BV，流速为1 mL·min-1，洗脱液每5 mL 接1 瓶，以洗脱体积为横坐标，以苯酚-硫酸法测得总糖含量为纵坐标，绘制洗脱曲线，合并糖含量高的洗脱组分，回收溶剂，得到甘草地上部分寡糖样品。

2.3 甘草地上部分寡糖的表征

2.3.1 凝胶渗透色谱法测定样品Mw标准曲线的制作：精密称取Mw为289 000、110 000、60 600、12 600、4320 的葡聚糖对照品，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的滤膜滤过除杂后进样。分析软件为Angilent GFC；检测流动相为0.1 mol·L-1硝酸钠溶液，流速为0.6 mL·min-1，柱温箱温度为35 ℃，示差检测器温度为40 ℃，进样量为20 μL，时间为45 min。

甘草地上部分寡糖测定：精密称量甘草地上部分寡糖样品，溶于去离子水中，配制成1 mg·mL-1的溶液，用0.22 μm 的滤膜滤过除杂后进样。用Angilent GFC软件分析计算样品Mw。

2.3.2 薄层色谱法鉴定样品成分 精密称量甘草地上部分寡糖样品10 mg，溶于去离子水10 mL中，配制成1 mg·mL-1的供试品溶液。精密称量对照品D-葡萄糖和D-果糖各2 mg，溶于去离子水10 mL 中，配制成0.2 mg·mL-1的对照品溶液。展开剂为乙酸乙酯-乙醇-吡啶-水（8∶2∶2∶1）。点样量为5 μL。显色剂为苯胺-二苯胺溶液（取苯胺1 mL和二苯胺1 g，同溶于100 mL 丙酮中，再加85%磷酸水10 mL，混匀，棕色瓶保存，现用现配），85 ℃加热10 min。

2.4 甘草地上部分寡糖体外抗氧化活性评价

精确称取DPPH 5 mg，用无水乙醇溶解并定容于50 mL 量瓶中，质量浓度为0.1 mg·mL-1，避光保存。取96 孔板，加入不同质量浓度（0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1）的甘草地上部分寡糖样品水溶液100 μL，再分别加入新配制的DPPH 溶液100 μL，避光反应30 min 后，用酶标仪在517 nm 波长下测定其A值。分别以去离子水和维生素C作为空白和阳性对照，每个质量浓度重复4次。按照公式（1）计算自由基清除率。

自由基清除率=[1-(Ai-Aj)]/A0× 100%（1）

式中，Ai为DPPH 100 μL 和样品溶液100 μL 混合液的吸光度；Aj为样品溶液100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度；A0为DPPH 100 μL 和水100 μL 混合液的吸光度。

2.5 甘草地上部分寡糖体内抗衰老活性评价

2.5.1 溶液配制 M9 缓冲液、NGM 培养基、LB培养基、线虫裂解液按照常规方法配制[21]。

2.5.2 线虫同步化 N2 线虫饲养于涂布有大肠杆菌E.coliOP50 的线虫标准培养基NGM 中，20 ℃下培养。挑取50 只左右产卵期成虫至1.5 mL 离心管中，加入线虫裂解液1 mL。涡旋混匀3～5 min，3000 r·min-1离心3 min（离心半径120 mm）；弃上清液至剩余液体0.1 mL，加入M9 Buffer 1 mL 混匀；重复此步骤2 次，最后保留液体0.1 mL，将液体滴加至新的线虫生长培养基（NGM）中，次日孵化出新的线虫。

2.5.3 氧化应激实验 将经过同步化生长至L4 期后的N2 线虫置于含或不含药物的NGM 中，实验分对照组和甘草地上部分寡糖给药组（质量浓度分别为10、20、40 μg·mL-1），每板30 条，48 h 后，把各组线虫转移到含有0.4% H2O2的线虫NGM 中观察，每0.5 h 记录线虫存活数目，直至线虫全部死亡，重复3次。

2.5.4 热应激实验 N2线虫分组同2.5.3项下。给药组线虫经不同质量浓度的甘草地上部分寡糖处理48 h 后与对照组线虫同时置于37 ℃培养箱中进行观察，每2 h 观察线虫死亡情况，记录并挑出死亡个体，直至线虫全部死亡，重复3次。

2.5.5 寿命实验 N2线虫分组同2.5.3项下，每组50条，给药后每48 h观察1次线虫的生存状态，记录死亡线虫数量并将其挑出，并更换新的含药或不含药NGM，直至所有线虫全部死亡，实验重复3 次。采用Kaplan-Meier 生存分析不同质量浓度组线虫的存活率差异。

2.5.6 脂褐素含量测定 N2 线虫分组同2.5.3 项下，给药处理5 d后，挑至滴加M9 1滴的2%琼脂片上，再滴加叠氮化钠溶液1 滴，待虫体变直，盖上盖玻片，于倒置荧光显微镜下观察不同组线虫体内的脂褐素水平，固定曝光时间和强度，拍摄荧光图片，拍摄条件为Ex 385 nm、Em 430 nm，使用Image J软件统计图片中脂褐素自发荧光强度。

3 结果

3.1 样品Mw测定及薄层色谱鉴别

建立葡萄糖标准曲线为A=8.526 8C-0.045 6（r=0.996 9），葡萄糖质量浓度为0.01～0.07 mg·mL-1有较好的线性关系。从甘草地上部分4 kg 中得到寡糖样品410 mg，苯酚-硫酸法测其总糖质量分数为81.23%。

采用高效凝胶渗透色谱法测定已知相对分子质量的葡聚糖，记录色谱峰保留时间，结果见图1。建立葡聚糖标准曲线：Y=-3.464 6X+41.284（r=0.992 7），X为lgMw，Y为洗脱时间。取Mw为289 000的葡聚糖标准溶液重复进样6 次，按上述色谱条件测定，葡聚糖标准溶液出峰时间的RSD为0.040 6%，说明该仪器精密度良好。取供试品溶液6 份，进样，按上述色谱条件测定，溶液出峰时间的RSD 为0.081 5%，说明该方法重复性良好。取供试品溶液6 份分别放置0、1、2、4、8、10 h，进样，按上述色谱条件测定，溶液出峰时间的RSD 为0.112%，说明样品稳定性良好。将样品配制成1 mg·mL-1的供试品溶液，通过高效凝胶渗透色谱法测定，结果见图2。样品的图谱不是对称的色谱峰，左侧可见多个肩峰，说明样品中含有多种糖类组分，将样品的洗脱时间最小肩峰值30 min 和峰值33.517 min 分别代入到回归方程，计算得到样品Mw为180～1800，判断为寡糖类成分。

图1 葡聚糖对照品的凝胶渗透色谱图

图2 甘草地上部分寡糖样品的凝胶渗透色谱图

以D-葡萄糖和D-果糖为对照品，采用薄层色谱法对样品进行分析，结果见图3。图3显示，样品中不含葡萄糖和果糖。

图3 D-葡萄糖、D-果糖、样品的薄层色谱图

3.2 甘草地上部分寡糖体外抗氧化活性评价

甘草地上部分寡糖样品清除DPPH 自由基能力测定结果见图4，不同质量浓度样品溶液对DPPH 自由基均有清除作用，并且在实验选取的质量浓度范围内呈现明显的量效关系。样品的半数抑制浓度（IC50）为0.220 2 mg·mL-1，抗氧化活性弱于阳性对照维生素C（0.016 9 mg·mL-1）。表明甘草地上部分寡糖样品具有一定的抗氧化活性。

图4 甘草地上部分寡糖样品与维生素C清除DPPH自由基的作用

3.3 甘草地上部分寡糖体内抗氧化应激及热应激活性评价

各组线虫在H2O2应激环境中培养的生存曲线见图5。与对照组比较，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1组线虫生存曲线均明显右移。在氧化应激条件下，各质量浓度样品组线虫存活率明显提高，与对照组比较，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1组线虫存活率差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1对线虫寿命延长作用最强，抗氧化应激能力最强。

图5 氧化应激下甘草地上部分寡糖对线虫寿命的影响

线虫在37 ℃环境中培养的生存曲线见图6。与对照组比较，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1组线虫生存曲线均明显右移。在热应激条件下各质量浓度样品组线虫存活率均明显提高，且差异有统计学意义（P＜0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1组线虫寿命延长作用最强，抗热应激能力最强。

图6 热应激下甘草地上部分寡糖对线虫寿命的影响

3.4 甘草地上部分寡糖对延缓线虫衰老的影响

如图7和表1所示，甘草地上部分寡糖各质量浓度组线虫生存曲线与对照组比较没有发生明显的偏移。甘草地上部分寡糖20、40 μg·mL-1组线虫平均寿命均高于对照组，但差异无统计学意义。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1组线虫最长寿命高于对照组，但差异无统计学意义。说明甘草地上部分寡糖对线虫寿命没有显著的延长作用。

表1 甘草地上部分寡糖对线虫寿命的影响（,n=150）

表1 甘草地上部分寡糖对线虫寿命的影响（,n=150）

图7 甘草地上部分寡糖对线虫寿命的影响

在荧光显微镜下可见线虫体内脂褐素自发蓝色荧光。随着线虫寿命的增加，脂褐素含量逐渐增多。给药5 d后，甘草地上部分寡糖10、20、40 μg·mL-1组线虫体内脂褐素荧光强度均明显降低，较对照组分别降低了23.8%、33.8%、23.4%，差异有统计学意义（P<0.01）。甘草地上部分寡糖20 μg·mL-1组线虫体内脂褐素荧光强度最低，对线虫体内脂褐素沉积减缓作用最强，见图8～9。

图8 给药5 d后各组线虫体内脂褐素荧光图（40×）

4 讨论

现代药理研究表明，甘草主要的抗氧化活性成分为黄酮类，包括甘草总黄酮[22]、查耳酮[23]、甘草苷[24]、异甘草素[25]等，同时甘草中三萜[26]和多糖[27-29]等成分也有一定的抗氧化作用。甘草水提液对具有细胞损伤作用的超氧阴离子自由基和羟基自由基均有明显的清除作用，并能抑制羟基自由基诱发的膜脂质反应，发挥一定的抗衰老作用[30]。甘草苷可以改善D-半乳糖所致衰老大鼠的学习记忆能力，减缓衰老引起的氧化损伤，提高脑内的抗氧化能力[31]。甘草水提物对D-半乳糖致衰老的大鼠具有肝保护、抗氧化和抗衰老作用[32]。

中药多糖来源广泛，具有调节免疫力、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤、调血脂、降血糖等多种生物活性，尤其在抗衰老方面有明显的优势，其抗衰老作用机制一直是中药多糖生物活性研究中的热点之一。当归多糖[33]、枸杞多糖[34]、肉苁蓉多糖[35]、海带多糖[36]、黄芪多糖[37]、锁阳多糖[38]、黄精多糖[39]、平贝母多糖[40]、女贞子多糖[41]、马齿苋多糖[42]等中药多糖均可通过抗脂质过氧化和清除自由基，调节端粒酶活性和机体的糖、脂质代谢，以及神经-内分泌功能等多种途径来发挥抗衰老作用。壳寡糖作为壳聚糖降解后的衍生物，能有效清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，具有较强的抗氧化活性[43]。系列褐藻胶寡糖通过清除活性氧自由基，来发挥抗氧化作用[44]。琼胶寡糖具有较强且广泛的抗氧化能力，对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基均存在较强的清除作用[45]。

本研究通过提取甘草地上部分，得到的水提物经过AB-8 型大孔吸附树脂、DEAE-52 纤维素、Sephadex LH-20 树脂等柱色谱进行富集纯化，得到甘草地上部分寡糖，质量分数为81.23%，说明该方法可以有效去除水提物中的蛋白质和色素，适宜于甘草地上部分寡糖的纯化。经凝胶渗透色谱法检测，样品Mw为180～1800，且薄层色谱鉴别显示样品不含葡萄糖和果糖，可判断样品为甘草地上部分寡糖类成分。其单糖组成及分子结构信息尚待进一步研究。样品对DPPH 自由基有较好的清除作用，能显著延长氧化应激、热应激下线虫寿命，减少线虫体内脂褐素沉积，具有良好的抗氧化损伤及抗衰老活性。说明甘草地上部分寡糖对秀丽隐杆线虫的氧化损伤和衰老具有一定的保护作用，在抗衰老方面具有一定的潜在药用价值，但其作用机制有待深入研究。本研究为甘草地上部分寡糖在抗氧化、抗衰老方面的进一步研究及相关食品、药品、保健食品等产品的开发提供了一定的理论依据，为天然产物的体外抗氧化、体内抗衰老活性评价的探究提供了一定的方法指导。

图9 给药5 d后甘草地上部分寡糖对线虫脂褐素沉积的影响（,n=30）