合成生物学在水稻基因工程及遗传改良中的应用研究进展

王 爽，何 勇，童晓红，应杰政，田志宏*，王以锋

（1.长江大学生命科学学院/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心/涝渍灾害与湿地农业湖北省重点实验室，湖北荆州 434025；2.中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室，浙江杭州 311400）

合成生物学是以系统生物学为研究基础，利用基因工程和工程学概念人工设计和改造现有的生物系统，以获得具有新功能生物体系的一门学科。近些年，合成生物学已成为农作物改良的重要手段和焦点领域，在提高农作物产量、增强作物营养品质等方面发挥着重要作用。

水稻是世界重要的主粮之一，它高度自交、花粉寿命短，作为转基因受体具有生态安全可控的特性。水稻作为合成生物学的载体具有以下明显优势：1）水稻易储存且蛋白不易因变性降解等导致功能损失；2）水稻产量较高，是我国居民的主食，在水稻上进行营养加强是提升全民健康的最便捷方式；3）作为真核生物，水稻具有类似人和动物的加工修饰系统，可以保证下游产物的活性；4）水稻高度自交是转基因生态安全的重要保证。本文综述了合成生物学在水稻生物反应器上取得的一系列进展。

1 生物医药方面的研究

1.1 人血清白蛋白

人血清白蛋白（Human scrum albumin，HSA）是一种可溶性、球状和非糖基化的单体蛋白，主要作为类固醇、脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白，在稳定细胞外液方面起着重要作用。HSA 在临床上广泛用于治疗严重烧伤、失血性休克、低蛋白血症和肝腹水等，也被用于癌症和艾滋病的辅助治疗［1-2］。在过去的几十年中，各种表达系统被用来产生HSA，包括大肠杆菌［3］、酿酒酵母［4］、乳杆菌［5］、转基因动物［6］、转基因植物［7-8］，虽然在这些系统中成功地表达了HSA，但它们都没有实现大规模、高效、低成本的目标。Yang 等成功地在水稻种子中表达重组人血清蛋白（rHSA），rHSA 水平达到水稻籽粒总可溶性蛋白的10.58%，大规模生产rHSA 产生的蛋白纯度＞99%，生产率为2.75 g·kg-1糙米［9-10］。将得到的OsrHSA 与众人血浆中提取的血清蛋白（pHSA）进行各项物理指标的对比，发现它们具有高度的一致性。在促进大鼠细胞生长和治疗肝硬化方面，OsrHSA 的效率与pHSA 相似。此外，OsrHSA 在体外和体内的免疫原性与pHSA相似。

1.2 人胰岛素样生长因子1

人胰岛素样生长因子1（Human insulin-like growth factors 1，hIGF-1）是一种由70 个氨基酸组成的单链小肽，是调节生长、存活和代谢的主要生长因子［11］。临床上，hIGF-1 用于有效治疗生长激素（GH）受体缺乏、GH 不敏感综合征、hIGF-1 基因缺失或GH 信号转导通路缺陷的患者［12］。此外，hIGF-1可有效用于治疗1 型和2 型糖尿病或严重胰岛素抵抗综合症患者［13］。Xie 等通过转基因水稻植株在种子中高度积累重组人胰岛素样生长因子1（rhIGF-1），达到种子总蛋白的（6.8±0.5）%［14］，相当于每粒（136±10）μg。功能分析表明，rhIGF-1 的融合作用在体外可刺激人乳腺癌细胞系MCF-7的增殖。动物试验表明，糖尿病小鼠口服未加工的转基因种子可显著提高血浆IGF-1水平，降低血糖。

1.3 纤维素生长因子

纤维素生长因子（Fiber growth factor，FGFs）是一类蛋白质家族，与肝素结合多肽在结构和生物活性上相似。到目前为止，已经分离出23 种不同的FGFs［15］。碱性纤维生长因子（Basic fibroblast growth facto，bFGF）是FGFs 的一种，它是一种单链蛋白，能刺激NIH/3T3 细胞的增殖，抑制干细胞的分化，并可能因其体外增殖，迁移和改变人气道平滑肌细胞收缩表型的能力而在治疗哮喘中发挥重要作用［16］；在临床上，bFGF 广泛应用于加速伤口愈合，也用于心血管和神经退行性疾病的有效组织修复和伤口愈合等方面［17-18］。An 等成功地在水稻胚乳中表达了重组bFGF，表达水平达到99.11～185.66 mg·kg-1糙米［19］，进一步的研究表明，OsrbFGF 对NIH/3T3 细胞增殖具有相同的刺激作用。纯化的FGF 与其他测试产品也具有相同的体内伤口愈合效果。

1.4 乳铁蛋白

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是80 kDa 铁结合糖蛋白的转铁蛋白家族的一个成员，具有单个多肽链和两个铁结合结构域，由乳腺、唾液腺和胰腺分泌，在人（1.0～3.0 mg·mL-1）和哺乳动物的初乳中含量最高。LF是一种多功能蛋白，具有多种生物活性，包括抗菌、抗病毒、调节铁的吸收、调节免疫系统和促进细胞生长等，被认为是一种新型抗菌、抗癌药物和极具开发潜力的食品和饲料添加剂。Nandi 等将一种合成人乳铁蛋白（HLF）的基因与水稻的glutelin 1启动子结合转入水稻中，得到了rHLF 表达水平为4.5～5.5 g·kg-1糙米的转基因水稻，并且能在水稻中稳定遗传［20-21］。进一步分析表明，rHLF 与人类HLF 在一系列的生化和生物物理指标高度相同。该产品目前已经商业化，名称为Lacromin。

1.5 人溶菌酶

人母乳中含有50～400 μg·mL-1溶菌酶（Homan iysozyme，Hlys），这种酶是母乳中最丰富的蛋白质之一，可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质，在抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等方面具有重要的作用。Huang 等通过利用Gt-1启动子及其信号肽区域构建了Hlys基因相应的表达载体，转入水稻中成功表达了rHlys［22］。溶菌酶的表达水平达到糙米重量的0.6%或可溶性蛋白的45%，并能在后代中稳定遗传。

2 疫苗生产方面的研究

2.1 猪蛔虫病疫苗

猪蛔虫病是由于猪蛔虫寄生在猪体内，导致生猪发育不良，严重者发育停滞，甚至造成死亡。该病在世界各地都存在并且相对广泛，是一种危害养猪业极为严重的寄生虫病，给养殖户经济收入造成巨大的压力。Yasunobu 等在胚乳特异性GluB-1启动子的控制下，在水稻胚乳中表达As16（Ascaris suum 16，一种猪蛔虫的保护性抗原）［23］。这种抗原以与霍乱毒素（CT）B 亚单位CTB 的嵌合融合蛋白的形式被生产，表达水平达到50 μg·g-1糙米。进一步实验表明，将含有As16 的水稻种子喂食小鼠，会引发小鼠体内产生As16特异性的血清抗体免疫应答。虽然疫苗的佐剂配方导致未能继续提高特异性免疫应答，但重组As16能诱导抗体表达，表明利用水稻胚乳生产该疫苗具有可行性。

2.2 阿尔茨海默病疫苗

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）亦称老年痴呆症，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，主要导致认识障碍。AD 的发生被认为是由于淀粉样β 肽（Aβ）沉积在大脑皮层［24］，由于Aβ是一种蛋白质，AD疫苗是潜在的治疗或预防手段。Yoshida 等将Aβ 基因与绿色荧光蛋白（GFP）结合后转到水稻中，得到的转基因水稻中Aβ-GFP 融合蛋白最高可达400 μg·g-1糙米［25］。通过将含有Aβ-GFP 融合蛋白的糙米喂给小鼠来评价Aβ 水稻的免疫原性，结果发现口服Aβ 米引起小鼠血清抗Aβ 抗体滴度升高，并且煮熟的Aβ 米并不会降低疫苗的有效性，从而允许其作为一种可食用的疫苗使用，因此Aβ 水稻可作为一种有效地预防阿尔茨海默病的疫苗。

3 膳食营养改良方面的研究

植物营养素和微量营养素在人体的营养与健康中起着重要作用，但它们往往在不同主食中表现不同程度的缺乏。此外，一些有利于健康的营养物质也在粮食作物中缺乏。因此，合成生物学对于提高粮食作物的营养健康物质含量具有重要的应用潜力。迄今为止，通过合成生物学的方法已经开发出富含类胡萝卜素的“黄金大米”［26-27］、富含花青素的“紫晶米”［28］、富含虾青素的“虾青米”［29］等。

3.1 富含花青素的“紫晶米”

花青素属于生物类黄酮物质，而黄酮物质最主要的生理功能是清除自由基和抗氧化能力，可以作为天然色素和营养强化剂应用到食品着色剂、抗衰老化妆品、保健等方面。Zhu 等开发一种高效的转基因堆积载体系统，并利用该系统构建了一个由胚乳特异性启动子驱动的8 个花青素相关基因（来自玉米的2 个调控基因和来自锦紫苏的6个结构基因），加上一个可选择的标记和一个用于标记切除的基因；将该载体转入水稻中产生了一种新的“紫色胚乳稻”（紫晶米）；其在胚乳中具有较高的花青素含量和抗氧化活性［28］。该研究为多基因堆积提供了一个高效、通用的工具包，可应用于复杂生物合成途径，在合成生物学和改善植物农艺性状方面具有显著的应用潜力。

3.2 富含类胡萝卜素的“黄金大米”

类胡萝卜素（carotenoids）是一类重要的脂溶性植物营养素，动物自身不能合成类胡萝卜素，故在促进人类营养和健康方面起着重要作用。流行病学研究表明，类胡萝卜素可以降低多种癌症、代谢综合征、肥胖、白内障及黄斑变性等疾病的发病率［30］。Ye 等将来自水仙花的八氢番茄红素合酶（phytoene synthase，psy）基因和来自细菌中的crtI基因转入水稻中，成功获得了在水稻胚乳中类胡萝卜素含量达到1.6 μg·g-1的“黄金大米”［27］。Paine 等为了提高类胡萝卜素的含量，将不同植物来源的psy基因在玉米的愈伤组织中表达，发现玉米和水稻的psy基因导致类胡萝卜素含量最高，胡萝卜、番茄、胡椒、拟南芥的psy表现为中间功效，水仙花psy表现最低；他们又将玉米、番茄、胡椒、水稻和水仙花psy的cDNAs 转入水稻，发现在T1代种子种类胡萝卜素含量最高的是玉米（14 μg·g-1）和水稻（18 μg·g-1），胡椒或番茄psy产生中间的类胡萝卜素含量，而水仙花psy产生的含量最低（1.2 μg·g-1），这与玉米愈伤中的实验结果一致［26］。

虾青素（astaxanthin）是一种红色酮类化合物，是一种类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物。在自然界，虾青素具有最强的抗氧化性。虾青素主要在一些微藻、细菌和酵母中合成，但在大多数高等植物和动物中不合成，因此人类主要从一些海洋食物中获得虾青素，如鲑鱼、贝类和鳟鱼。Zhu 等利用自己开发的TransGene Stacking II（TGS II）将虾青素合成途径的sZmpsy1，sPaCrtI，sCrBKT和sHpBHY四个基因转入水稻中，在水稻胚乳中建立了虾青素生物合成途径，使得虾青素在胚乳中富集，并且具有较高的抗氧化活性［29］。

4 农艺性状改良方面的研究

据联合国经济与社会事务部预测，至2050年，全球人口将增至97亿。如果农作物产量依然维持在现有水平，届时，人类必将面临严重的粮食短缺局面。因此，提高农作物产量、改良农艺性状就变得尤为重要。植物的产量与光合作用的效率紧密相关，因此，提高农作物的光合作用效率是关键。Shen 等将水稻自身的三个基因：OsGLO3（乙醇酸氧化酶）、OsOXO3（草酸氧化酶）和OsCATC（过氧化氢酶）组合在一起成功构建了一条新的光呼吸支路，简称GOC 支路；将该支路转化到水稻（GOC 植物）中，通过这三种酶在叶绿体的作用可以将乙醇酸依次完全氧化成CO2，形成一种类似C4植物的光合CO2浓缩机制；GOC 植物的光合效率、生物量、氮含量和籽粒产量等均得到显著增强；该研究还发现，GOC 水稻在高光条件下更有优势［31］。

5 问题与展望

虽然合成生物学在水稻中已经取得一系列重大进展，但是仍然存在诸多困难和挑战。比如在利用水稻胚乳生产药用蛋白方面，目前除HIys、LF 和HSA 已在生产中应用外，多存在表达水平低、纯化生产成本较高等问题，导致产业化困难。

从分子生物学的角度来看，目前提高水稻胚乳中活性蛋白产量主要的方法在于提高特异性启动子的启动效率，以及特异的增强合成活性蛋白的表达积累。

而在合成代谢产物方面，主要问题是了解生物体中的代谢途径和关键调节因子。尽管有越来越多的植物基因组被测序，但由于缺乏有效的基因功能注释，使得很难确定编码完全代谢途径中关键酶的基因组成。而且组成的合成代谢产物很可能导致细胞发育和生长异常。同时，代谢途径容易受到反馈调节等因素的影响。

随着全球气候变暖，极端天气频繁出现而可能引发的粮食危机，大力发展新的科学技术保障世界粮食安全日趋紧迫。水稻作为世界上主要的粮食作物之一，改良其农艺性状尤为迫切，目前利用合成生物学原理提高植物的光合效率是当前进一步大幅度提高水稻产量的有效手段。如何改造、优化当前光合作用系统，使得光能利用效率提高进而增加作物产量，仍是需要我们解决的重大问题。相信合成生物学的研究将在提高水稻产量、增强营养品质等方面发挥重要作用。