陆地棉与金花葵花朵差异代谢物筛选与分析

甄军波 宋世佳 刘琳琳 刘 迪 欧阳艳飞 迟吉娜*

(1.河北省农林科学院 棉花研究所/农业农村部黄淮海半干旱区棉花生物学与遗传育种重点实验室,石家庄 050051; 2.河北省农林科学院 人事处,石家庄 050051)

植物能产生数量众多的代谢物，这些代谢物在植物生长发育、应对生物胁迫和非生物胁迫的过程中发挥着重要的作用，同时，代谢物也是连通植物基因型和表型的重要“桥梁”[1-3]。棉花和金花葵的花在形态上有很高的相似度，本研究室前期开展的金花葵转录组测序结果表明，金花葵基因和棉花基因序列具有很高的相似度，组装的Unigene比对物种相似度最高的是雷蒙德氏棉(28.83%)，其后依次是陆地棉(18.89%)、亚洲棉(16.31%)，合计有64.03% 的Unigene与棉花的序列有很高的相似度，可见，两者具有很近的亲缘关系。

棉花是世界上重要的纤维和油料作物，同时也是盐碱地改良的先锋作物，我国已经是世界上最大的原棉生产国，新疆是我国最大的棉花种植区域和原棉生产区[4-6]。近年来，随着劳动力等棉花种植成本的增加，植棉效益有所下降，因此，积极开拓棉花利用的新途径，提高棉花产品的利用率，将有利于提高棉花种植的经济效益[7-8]。棉花作为半木本植物，秸秆是棉花重要的副产品之一，其有机物含量高，是一种丰富的可再生资源[5]，秸秆资源丰富、价格便宜，还是食药用菌栽培基质的重要来源[9]。

金花葵又名菜芙蓉和野芙蓉，为一年生草本植物，花朵可加工成花茶，茎和叶片可加工成粉，作为食品添加剂使用[10]。研究表明，金花葵富含黄酮、有机酸、核苷类、氨基酸、多糖、维生素E、矿物质、多种微量元素和植物纤维[11-15]。黄酮类物质等成分具有解热消炎、镇痛，抗氧化和降血脂等多种药理活性作用，有机酸类成分、核苷类物质具有抗氧化，抗病毒，抗肿瘤，抗血小板凝集等多种药理活性，多糖则具有免疫调节和抗肿瘤活性[10,14,16]，虽然还没有被收入药典中，但是金花葵兼具食用、药用和保健功能，具有较高的营养价值。

由于棉花的无限生长习性[17]，棉花花朵也是可利用的资源之一。目前，关于棉花代谢物的研究中，更多的是研究代谢物在棉花抵御病虫害过程中发挥的作用[18-21]，而对于棉花花朵中的有益代谢物以及利用价值的研究鲜见报道。本研究利用代谢组学分析陆地棉和金花葵的花朵中共有代谢物和差异代谢物，旨在探明棉花花朵中潜在的有利用价值的代谢产物，以期为提高棉花综合利用率提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用材料均种植于河北省农林科学院棉花研究所小安舍实验站，所用陆地棉材料为研究室多年自交非转基因材料‘JZ-1’，取开花当天10：00的花朵，金花葵的花取自‘冀金葵1号’开花当天10：00的花朵，每组样品3次生物学重复。采集的样品送迈特维尔(武汉)生物科技有限公司开展代谢组学检测。

1.2 代谢组学统计分析

参考Chen等[22]和戴宇樵等[23]的方法，基于迈维自建数据库MWDB(Metware database)，根据二级谱信息进行物质定性，利用三重四级杆(QQQ)质谱多反应检测代谢物数据。以差异倍数(fold change)≥2.0或者差异倍数(fold change)≤0.5，结合OPLS-DA模型中VIP≥1.0筛选差异代谢物。

2 结果与分析

2.1 主成分分析

在主成分分析中，第一主成分的贡献率为76.12%，第二主成分的贡献率为8.46%，2种主成分贡献率之和为84.58%，表明2种主成分能够反映陆地棉和金花葵样品的主要特征信息。由图1可见，在OPLS-DA模型中，代谢物越靠近左下角和右上角，表明其差异性越显著。

2.2 代谢组学筛选

通过代谢组学分析，在陆地棉和金花葵中共检测到代谢物465个，有196个代谢物在两者之间差异不显著，筛选到差异显著表达代谢物269个，主要包含黄酮类(92种)、氨基酸及其衍生物(36种)、酚酸类(35种)、脂质类(29种)、生物碱类(20种)、有机酸(12种)、鞣质(12种)、核苷酸及其衍生物(10种)、木脂素和香豆素(5种)以及萜类(1种)和其他类(17种)。在陆地棉中117种代谢物的含量高于金花葵，仅在陆地棉中检测到的代谢物有41种(表1)；在金花葵中152种代谢物含量高于陆地棉，仅在金花葵中检测到的代谢物有29种。

2.3 差异代谢物KEGG富集分析

由图2可知，共有123个差异代谢物被注释到68个KEGG代谢通路上，陆地棉和金花葵花朵差异表达代谢物主要集中于代谢、次生代谢物合成、黄酮及黄酮醇合成、类黄酮生物合成、氨基酸生物合成及苯丙烷生物合成等代谢通路。

2.4 黄酮类物质

由表2可知，在陆地棉和金花葵的花中，共检测到黄酮类物质132种，有92种黄酮类物质在两者之间存在显著差异。在金花葵中36种黄酮类物质含量高于陆地棉，有13种黄酮类物质仅在金花葵中检测到，差异最小的为二氢杨梅素(蛇葡萄素)，是陆地棉含量的2.2倍，差异最大的为异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖苷，是陆地棉含量的2.58×106倍。在陆地棉中56种黄酮类物质含量高于金花葵，有19种仅在陆地棉中检测到，差异最小的为金圣草黄素 O-乙酰基己糖苷，是金花葵含量的2.2倍，差异最大的是儿茶素-(7,8-bc)-4α-(3,4-二羟基苯基)-二氢-2-(3H)-吡喃酮，是金花葵含量的2.4×106倍。陆地棉和金花葵的花中均检测出具有药用价值的金丝桃苷和槲皮素，这2种物质在陆地棉和金花葵花中的含量差异均不显著，但是金花葵中的芦丁是陆地棉含量的7.5倍，杨梅素含量是陆地棉含量的7.0倍。可见，陆地棉的花中也含有种类丰富的黄酮类物质。

，代谢物VIP≥1.0；，代谢物的VIP<1.0 ， Metabolite VIP≥1.0； ， Metabolite VIP<1.0图1 陆地棉和金花葵花朵中代谢物的OPLS-DA S点图Fig.1 OPLS-DA S-plot map

表1 仅在陆地棉中检测到的代谢物Table 1 Metabolites only detected in Gossypium hirsutum L.

表1(续)

图2 KEGG代谢通路富集情况Fig.2 Enriched column map of KEGG

表2 陆地棉和金花葵中差异显著的黄酮类物质Table 2 Flavonoids detected with significant difference in Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

表2(续)

表2(续)

2.5 氨基酸及其衍生物

由图3可知，在陆地棉和金花葵的花中共检测到56种氨基酸及其衍生物，其中共有36种氨基酸及其衍生物含量差异显著。金花葵和陆地棉的花中均检测到7种人体必须氨基酸，但是金花葵中的含量比陆地棉更高。陆地棉中含量比金花葵中高的氨基酸及其衍生物有4种，分别为顺式-4-羟基-D-脯氨酸、L-无水天冬酰胺、N-乙酰苏氨酸和组胺，陆地棉花朵中含有很多重要药用和食用价值的氨基酸及其衍生物。

图3 陆地棉和金花葵花朵中氨基酸及其衍生物之间的差异Fig.3 Differences between amino acids and derivatives in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

2.6 酚酸

在陆地棉和金花葵的花朵中共检测出酚酸类物质66种，其中31种酚酸类物质在陆地棉和金花葵之间差异不显著，包括阿魏酸、丁香酸和绿原酸等物质。由图4可知，陆地棉中的肉桂酸、对香豆酸和咖啡酸等肉桂酸型酚酸的含量高于金花葵；对羟基苯甲酰苹果酸、短叶苏木酚酸、水杨酸苄酯、对-香豆醇、肉桂酸、香豆醛和岷江百合苷等7种物质仅在陆地棉的花中检测到；金花葵中的芥子酸和香草酸含量更高；芥子酸甲酯、松果菊苷、芥子酰咖啡酰酒石酸、西伯利亚远志糖A5、芥子酰葡萄糖醛酸和松柏苷仅在金花葵的花朵中存在。

2.7 生物碱、有机酸、脂质和核苷酸及其衍生物

由图5可知，金花葵的花朵中富含生物碱，共检测到生物碱类物质24种，有13种生物碱含量高于陆地棉，包括药用成分盐酸多巴胺。陆地棉中有7种生物碱的含量比金花葵高，其中包括有药用价值的色胺。

由图6可知，金花葵的花中有机酸含量丰富，富含富马酸、酒石酸和莽草酸等具有药理作用的有机酸；陆地棉中2种有机酸比金花葵的花含量高，分别为辛二酸和奎尼酸；16种有机酸在陆地棉和金花葵中差异不显著。

由图7可知，在金花葵和陆地棉的花朵中，有29种脂类物质的含量差异显著，32种脂类物质的含量差异不显著，金花葵中含有种类丰富的溶血磷脂，陆地棉中溶血磷脂酰胆碱18∶4(18表示碳原子数目，4表示不饱和键数目)的含量比金花葵高。此外，金花葵和陆地棉均富含有益人体健康的不饱和脂肪酸，如亚油酸和亚麻酸等。核苷类成分是生物维持生命活动的重要物质，尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、胸苷、胞苷、尿嘧啶核苷、2-脱氧腺苷、腺苷和鸟苷等物质在陆地棉和金花葵中的含量差异不显著，有10种核苷类物质在金花葵和陆地棉中的含量存在显著差异(图8)，陆地棉中脱氧胞苷和鸟嘌呤的含量更高。

图4 陆地棉和金花葵花朵中酚酸之间的差异Fig.4 Difference between phenolic acid in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图5 陆地棉和金花葵花朵中生物碱之间的差异Fig.5 Difference between alkaloids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图6 陆地棉和金花葵花朵中有机酸之间的差异Fig.6 Difference between organic acids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图7 陆地棉和金花葵花朵中脂质之间的差异Fig.7 Difference between lipids in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

2.8 鞣质、木脂素和香豆素及其他物质

由图9可知，陆地棉的花中有种类更加丰富的鞣质类物质，主要包括原花青素A3、棕儿茶素B3、槟榔鞣质B1、肉桂单宁和三儿茶素等原花青素，其中，槟榔鞣质A2、槟榔鞣质B1、肉桂单宁B2、三儿茶素、原花青素A3、原花青素C1、原花青素C2和棕儿茶素B3等8种原花青素仅在陆地棉中存在。

陆地棉的花朵中东莨菪苷、东莨菪内酯、5,7-二甲氧基香豆素含量比较高，金花葵中罗汉松脂素和松脂醇含量比较高，金花葵和陆地棉中均含有药用成分七叶苷，见图10。同时，还有一些物质被归为其他类，包括棉酚、半棉酚、脱氧半棉酚等物质，在金花葵和陆地棉中的含量均有显著的差异(图11)。

3 讨 论

陆地棉和金花葵同属锦葵科植物，两者的花在开花后的形态和颜色等方面很相似，棉花是世界上重要的纤维和油料作物，同时，棉花的棉籽壳、棉籽油和棉根皮都具有重要的药用价值[24-25]，此前针对棉花开展的转录组和代谢组学的研究更多的集中于棉花的纤维发育[26]和体细胞再生[27]等方向，有必要对棉花的花开展代谢组学研究，以充分开发其潜在的药用价值。

图8 陆地棉和金花葵花朵中核苷酸及其衍生物的差异Fig.8 Differences between nucleotides and derivatives in flowers ofGossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图9 陆地棉和金花葵花朵中鞣质之间的差异Fig.9 Difference between tannins in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图10 陆地棉和金花葵花朵中木脂素和香豆素之间的差异Fig.10 Differences between lignans and coumarins in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

图11 陆地棉和金花葵花朵中其他类物质之间的差异Fig.11 Differences between other metabolites in flowers of Gossypium hirsutum L. and Aurea helianthus

黄酮类物质是植物中非常重要的一类次生代谢物，Nix等[28]研究表明，棉花的花朵、叶片、根、茎、种子和棉铃中均存在黄酮类物质，合计有52种黄酮类物质，其中棉花的花朵中黄酮类物质的种类最丰富。Xu等[29]利用靶向代谢组学对开花当天和开花后1 d棉花花朵中的黄酮类物质进行了鉴定，检测出了7种黄酮类物质，包括异黄酮、花青素、黄酮醇、黄酮碳糖苷、儿茶素衍生物、黄烷酮和黄酮。该研究还表明，异槲皮苷是黄酮类中含量最高的成分，但并没有检测出查尔酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇和黄烷醇类物质。本研究结果表明，陆地棉和金花葵中均含有具有药用价值的黄酮类物质，金丝桃苷是黄酮类中主要的药用成分[15]，共检测到9类黄酮类物质，包括查耳酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、花青素、黄酮、黄酮醇、黄酮碳糖苷、黄烷醇类和异黄酮，并没有检测出儿茶素衍生物和黄烷酮类物质。不同研究检测出的黄酮类物质的差异，可能与花朵的取样时期不同有关，此外，随着人们对于黄酮类物质研究的不断深入和检测技术的进步，一些新的黄酮类物质也在不断增加，因此，棉花花朵不同发育时期黄酮类物质的代谢规律有待进一步研究。

除黄酮类物质外，棉花还富含其他种类丰富且具有一定药用价值的代谢物，棉花的花朵中含有人体必须的7种氨基酸，阿魏酸和绿原酸等酚酸，酚酸具有抗氧化和抑菌等生物活性[30]，棉花中还含有含量更高且具有药用价值的色胺[31]，陆地棉和金花葵也都含有丰富的有机酸和核苷类物质，以及有药用价值的溶血磷脂[32]。此外，陆地棉的花中富含种类丰富的原花青素，原花青素在人体抗氧化、抗炎和抗菌等方面均具有非常重要的作用[33]，陆地棉也含有种类丰富的香豆素，陆地棉中这些具有潜在药用价值的次生代谢物有待进一步开发和利用。

4 结 论

本研究利用代谢组学检测陆地棉和金花葵开花当天的花朵中的代谢物，结果表明，金花葵在氨基酸及其衍生物、生物碱、有机酸、脂质和核苷酸及其衍生物等次生代谢物的种类和含量上比陆地棉的花朵更加丰富，陆地棉的花中含有的黄酮、酚酸、鞣质和香豆素等次生代谢物更加丰富，陆地棉的花朵中也检测到有药用价值的氨基酸及其衍生物、生物碱、有机酸、脂质和核苷类物质，这些物质都具有药用价值。