哈尼梯田稻-渔共作模式下杂交黄颡鱼肠道微生物研究

朱昊俊 强 俊 徐钢春 陶易凡 包景文 徐 跑

(1. 南京农业大学无锡渔业学院, 无锡 214128; 2. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心, 农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室, 无锡 214081)

水环境内的微生物在水产养殖生态系统中发挥着重要作用, 如污染物降解、氨氮循环和水体净化等。同时, 鱼类肠道中栖息着众多微生物, 维持着肠道内环境的稳定[1]。健康个体肠道微生物的组成保持相对恒定, 同时又具有个体差异, 它们可以参与机体的蛋白质、碳水化合物、维生素和氨基酸等代谢过程[2]。肠道菌群对宿主的营养、生理和免疫均有不同程度的影响, 不同的养殖模式和水体环境会显著改变养殖动物的健康及肠道微生物结构[3,4]。目前对于水产动物肠道健康相关研究越来越全面和丰富, 已经从最初的肠道形态学, 逐步发展到肠道微生物平衡和鱼类肠道健康相关机制的探索。

稻渔综合种养模式是在我国传统稻田养鱼基础上利用互利共生的原则, 建立起多物种共栖, 多层次利用的一种新型农业模式[5,6]。自2012年第一次提出“稻渔种养”概念以来, 得到了各方的充分认可, 在全国范围内大力推广, 已经成为水产养殖领域内一个亮点。稻渔综合种养模式是以种粮为主,养殖为辅, 稻田内增加水产品养殖不破坏稻田的耕作层, 因此水稻的产量不会减产, 甚至有些条件下可以增产; 与此同时, 稻渔综合种养模式可以降低农药和化肥的施用, 收获的有机水稻和水产品经济效率良好, 可以大幅度提升农户收益[7]。在生产实践中, 根据各地气候、地质和当地消费环境等因素,可以采用中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、小龙虾(Procambarus clarkii)、中华鳖(Pelodiscus sinensis)和泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)等多种水产品。

位于云南红河县的哈尼梯田历史悠远, 但是迫于现实环境, 可持续发展受到严峻考验。中国水产科学研究院淡水渔业研究中心在哈尼梯田试验了水稻-黄颡鱼的“稻渔共作”综合种养模式。黄颡鱼是我国一种优质的淡水养殖品种, 黄颡鱼肉质鲜美,营养丰富, 且无肌间刺, 深受消费者的好评[8]。梯田内饵料资源丰富, 无需额外投入饵料, 收获的黄颡鱼深受消费者喜爱, 丰富当地“菜篮子”的同时经济效率显著, 是实施精准扶贫的有力举措[9]。

目前关于综合种养的研究主要是集中在生态学及环境学方面(土壤理化性质和温室气体排放等), 对于稻田内微生物多样性方面的研究较少[10—12]。新一代测序技术的发展使得我们可以有效的对微生物进行宏观分析, 其结果改变了对微生物群落和其生态位之间相互作用的认识[13—15]。这些研究充分肯定了动物肠道内微生物种群和功能的多样性。在本次研究中, 采用高通量测序技术(16S rDNA)对稻-鱼共作综合种养模式和传统池养养殖模式下黄颡鱼肠道微生物组成进行比较, 探究不同养殖模式对黄颡鱼肠道微生物多样性和组成方面的影响,以期为水稻-黄颡鱼这种新型稻渔综合种养模式提供科学的数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验区选择

本次试验选取的试验田位于红河县(云南省红河哈尼族自治州), 坐标是: 东经102°23′54″, 北纬23°17′52″, 海拔634 m(图 1)。梯田依山而建, 年平均气温22℃左右, 梯田的水源为山上不断渗出的微流水。

图1 采样地点图Fig. 1 Location of sampling sites

1.2 试验设计

试验选取一块约800 m2的梯田作为稻-鱼共作组(DY组), 由于受当地环境限制, 在同一海拔附近较难找到一处面积相似的池塘作为对照组, 故而在海拔接近、水源来源一致的地方选择一个面积为200 m2池塘作为池塘组(CT组)。水稻进行移栽(株间距为20cm, 品种为“紫谷”)后, 于5月15日在梯田内投入约杂交黄颡鱼(Tachysurus fulvidraco♀×Pseudobagrus vachellii♂)苗400尾(梯田内鱼苗密度为0.5尾/m2), 杂交黄颡鱼平均体重为(16.1±1.0) g,同一时间以同样的密度在池塘内投放相同规格的杂交黄颡鱼苗。杂交黄颡鱼苗是由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心和广东五龙岗水产科技发展有限公司共同繁育的杂交黄颡鱼。

1.3 样品采集

在整个实验期间水稻田内不施用农药和化肥,稻田内蓄水高度维持在5—10 cm。定期巡田, 检查水位情况。整个养殖周期内DY组不单独投喂饲料,池塘组每日投喂商品颗粒饲料1次。8月23日, 在进行水稻收割前进行采样, 养殖周期为100d。在CT组和DY组随机各选取黄颡鱼12尾, 解剖采集肠道样本(肛门前5 cm左右), 液氮冷冻保存, 用于提取总DNA。采样时DY组和CT组黄颡鱼平均体重为(52.2±3.6) g和(55.8±2.5) g。

1.4 总DNA提取和16S rDNA测序

取肠道样本(-80℃冰箱冻存)放置在冰块上解冻, 放入研钵后加入液氮研磨至粉末, 使用预先冷冻处理的2 mL离心管, 称量100 mg左右样本进行总DNA提取。所有样品使用TIANGEN粪便提取试剂盒(DP328)提取肠道微生物总DNA, 操作根据试剂盒说明进行, 提取完毕后使用NanoDrop Lite微量核酸检测仪进行浓度测定, 使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。PCR扩增采用高保真DNA聚合酶, 扩增产物能真实反映细菌的原始序列情况,并保证同一批样本的扩增条件一致。采用的16S rDNA引物如下, 341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′;805R: 5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。

PCR扩增程序: 98℃预变性30s; 32次循环(98℃变性10s, 54℃退火30s, 72℃延伸45s); 72℃延伸10min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳进行检测,对目标片段使用AxyPrep PCR Cleanup Kit回收试剂盒进行回收。纯化后的PCR产物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Qbit 荧光定量系统上对文库进行定量, 合格的文库浓度应在2 nmol/L以上。将合格的上机测序文库(Index 序列不可重复)梯度稀释后, 根据所需测序量按相应比例混合,并经NaOH 变性为单链进行上机测序, 使用NovaSeq测序仪进行2×250 bp的双端测序。采用杭州联川生物有限公司的NovaSeq PE250平台进行高通量测序。

1.5 数据分析

样品在IlluminaNovaSeq平台上按照制造商的建议进行测序, 根据双端序列的重叠区, 根据样品独特的条形码, 将配对端序列分配给样品, 并将建库引入的barcode和引物序列去除。使用FLASH合并匹配端读取。根据Fqtrim(v0.94)在特定的过滤条件下对原始读数据进行质量过滤, 以获得高质量的clean标签。使用Vsearch(v2.3.4)软件对嵌合序列进行过滤。使用DADA2 进行解调, 得到特征表和特征序列。Alpha多样性和Beta多样性通过归一化到相同的随机序列进行计算。然后根据SILVA(release132)分类器, 利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。Alpha多样性用于分析样本物种多样性的复杂性, 通过4个指标, 包括Chao1、Observed_Feature、Shannon和Simpson, 这些指标都是用QIIME2计算出来的, 显著性检验使用t检验(Student’sttest)。Beta多样性由QIIME2计算, R(v3.5.2)包绘制。采用Blast进行序列比对, 每个代表性序列用SILVA数据库对特征序列进行注释。主坐标分析(PCoA)分析使用QIIME2进行, 显著性检验采用ADONIS检验。用Wilcoxon秩和检验确定了样品间α-多样性和相对丰度差异的显著性。显著差异肠道菌群的筛选使用LefSe分析, 设定P＜0.05, LDA值＞3。利用Bugbase 数据库进行细菌表型预测, 并进行组间差异分析[16]。在各显著性检验中, 显著差异P＜0.05。

2 结果

2.1 样本质量评估

经过质量控制后, 24个样本总共获得合格的16S rDNA序列2008079条, 平均每个样本有效序列数量为83670条。通过过滤、去重和嵌合体过滤等方式修正错误, 共获得1825个feature, 其中2个处理共有feature数量为392个, 归属于25个门、57纲、140个目、257个科、545个属和838个种。根据稀释度曲线可知(图 2), 曲线逐渐趋于平缓, 测序所得数据可以覆盖样本绝大多数物种, 测序数据适合进行下一步数据分析。

图2 样本稀释曲线Fig. 2 Rarefaction curves and estimators of different samples

2.2 不同养殖模式对肠道微生物Alpha多样性的影响

Alpha多样性是指一个特定环境或生态系统内的多样性, 主要用来反映物种丰富度和均匀度(图 3)。结果显示, CT组的辛普森指数(Simpson)和香农—威纳指数(Shannon)显著低于DY组(P＜0.05), 而Chao1和Observed_feature指数没有显著差异(P＞0.05)。

图3 不同养殖模式肠道微生物Alpha多样性指数Fig. 3 Alpha diversity under different culture modes

2.3 不同养殖模式对肠道微生物Beta多样性的影响

主坐标分析(Principal coordinates analysis, PCoA)是将进化结构中相近的物种聚类在一起, 样本间距离越近, 说明样本之间的微生物结构越相似。对不同养殖模式的24个样本的PCoA分析如图 4所示。在同一养殖模式下各样本聚集, 不同养殖模式样本间明显区分, 表明不同养殖模式下黄颡鱼肠道微生物结构具有明显不同, 基于Unweighted_UniFrac和Weighted_UniFrac的结果均具有显著差异性(P＜0.05)。

图4 不同养殖模式肠道微生物PCoA分析Fig. 4 Principal coordinates analysis of intestinal microbiota in different culture modes

2.4 不同养殖模式对肠道微生物组成和相对丰度的影响

为了确定与不同养殖模式相关的feature, 进行差异feature分析。通过韦恩图(图 5)可知, CT组和DY组共享的feature有392个, 占总feature的21.5%,而2个不同养殖模式特有的feature数量基本相当,分别为750个(41.1%)和683(37.4%)。同时, 采用曼哈顿图来展示相较于DY组, CT组内显著富集或者显著降低的feature(图 6)。结果显示, 相较于DY组,CT组显著下降的feature数量要明显多于显著富集的feature(120vs. 32)。同时, 差异feature主要集中在厚壁菌门(Firmicutes), 其次是变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes), 且梭杆菌门(Fusobacteria)只有显著下降的feature。

图5 不同养殖模式下feature韦恩图展示Fig. 5 Venn diagram showing feature in CT vs.DY yellow catfish

图6 不同养殖模式下差异feature曼哈顿图展示Fig. 6 Manhattan plots showing enriched and depleted feature in CT vs. DY yellow catfish

对样本中平均相对丰度大于1%的feature进行相对丰度和差异分析(图 7)。在门水平上(图 7a),不同养殖模式下优势菌群均为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria), 4个优势菌门占比均大于98%。而根据图 7b可知, 变形菌门(64.8%vs. 31.2%), 厚壁菌门(10.7%vs. 36.7%)和拟杆菌门(12.5%vs. 20.2%)在不同养殖模式下相对丰度存在显著差异(P＜0.05), 而梭杆菌门(10.8%vs. 10.4%)则没有显著差异(P＞0.05)。在属水平上(图 7c), 相对丰度大于1%的属有18个, 具体为: 柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、醋酸杆菌属(Cetobacterium)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、巴恩斯氏菌科_未鉴定(Barnesiellaceae_unclassified)、假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium_sensu_stricto_1)、Romboutsia属、无色杆菌属(Achromobacter)、Paludibacter属、Epulopiscium属、不动杆菌属(Acinetobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、气单胞菌属(Aeromonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、Turicibacter属、沙雷氏菌属(Serratia)、乳球菌属(Lactococcus)、短波单胞菌属(Brevundimonas)。经差异分析(图 7d)和LEfSe分析可以发现(图 7e),CT组中显著富集的属主要是变形菌门, 而DY组显著富集的属主要是厚壁菌门和拟杆菌门。18个优势菌属中6个属存在显著差异(P＜0.05), 具体为显著富集于CT组的邻单胞菌属(14.8%vs. 2.3%)和显著富集于DY组的梭状芽孢杆菌属(1.2%vs. 12.8%)、Romboutsia属(0.5%vs. 12.5%)、Paludibacter属(1.2%vs. 7.4%)、Epulopiscium属(1.3%vs. 4.5%)、拟杆菌属(0.4%vs. 4.6%)。

图7 不同养殖模式下肠道微生物的优势菌相对丰度和差异分析Fig. 7 Relative abundance and difference analysis of feature identified in CT vs. DY yellow catfish

为进一步了解不同养殖模式下肠道微生物菌群的差异性变化, 我们对细菌表型进行分析, 使用BugBase算法来对细菌表型进行预测, 探究不同的养殖模式是否会对肠道微生物种群的功能和表型产生影响。BugBase表型预测分析了7种表型特征(图 8), 包括好养(Aerobic)、厌氧(Anaerobic)、兼性厌氧(Facultatively_Anaerobic)、革兰氏阴性(Gram_Positive)、革兰氏阳性(Gram_Negative)、生物膜形成(Forms_Biofilms)和潜在致病性(Potentially_Pathogenic)。CT组相较于DY组革兰氏阴性菌丰度显著增加, 而革兰氏阳性菌丰度显著减少。在氧气需求方面, 好养菌丰度没有显著差异, CT组在厌氧菌方面丰度显著低于DY组, 而兼性厌氧菌丰度则显著升高。同时, CT组在表型方面具有更高的生物膜形成能力和潜在致病性。

图8 BugBase预测得到的不同养殖模式下肠道菌群表型分析Fig. 8 Phenotype analysis of intestinal microflora in CT vs. DY yellow catfish predicted by BugBase

3 讨论

肠道微生物在宿主体内的定植与稳态对宿主具有重要意义, 其对宿主的营养代谢、免疫应答、疾病状态甚至行为均会产生影响[17—20]。肠道微生物来源于环境, 同时受遗传背景和食物等因素的影响, 其与宿主之间的关系现在越来越受研究者们的关注。本研究发现不同的养殖模式可以显著地改变肠道微生物群落结构。

3.1 Alpha多样性和 Beta多样性分析

Alpha多样性和Beta多样性是评估群落结构组织化水平的重要参数[21]。Alpha多样性是反应肠道微生物丰富度和均匀度的综合指标。Chao1和Observed_feature指数主要反映样本的物种丰富度, 数值越高表明群落的丰富度越好; 辛普森指数(Simpson), 香农-威纳指数(Shannon)主要综合体现物种的丰富度和均匀度, 辛普森指数和香农-威纳指数数值越大, 表明群落的均匀度越高。CT组在物种丰富度上略低于DY组, 但是没有显著差异, 从韦恩图上也可以看出CT组和DY组共有392个共享feature, 而专有feature的数量基本一致; 相对的,CT组的辛普森指数和香农-威纳指数显著低于DY组, CT组在物种均匀度方面要显著低于DY组。通过曼哈顿图可知相较于DY组, CT组拥有120个相对丰度显著下降的feature, 显著上升的数量仅为32个, CT组肠道微生物相对丰度集中于更少的几个优势feature。不同养殖模式对肠道微生物的丰富度影响较小, 但会显著影响其均匀度。Beta多样性是通过算法将各样本序列的进化关系和丰度信息转换为样本间距离, 直观反映样本组间的群落差异[21]。本研究中不同养殖模式下的2个处理组被明显分为2个亚群, 且具有显著的统计学差异。相较于传统的池塘养殖模式, DY组稻渔共作养殖模式是一种水稻和水生经济动物互利共作复合生态模式, 更加有利于营养的转移、能量的代谢, 其具有更良好的生态效应[22,23]。

养殖对象的生产性能与养殖环境(土壤和水体)之间的关系密不可分。通过对稻鳖共作的研究发现共作组的水稻稻谷、秸秆和中华鳖产量均高于单作组, 共作组拥有更好的水环境, 促进中华鳖饵料利用率, 有利于其生长发育, 而中华鳖的加入可以抑制田间杂草的生长(与水稻营养性竞争)[24]。在稻渔共作模式下黄颡鱼肠道微生物多样性上升,特别是均匀度显著提升, 可能与稻渔共作模式下良好的生态效应有关(有利于营养的转移和能量的代谢)。肠道微生物多样性与机体的健康密切相关[25]。肠道微生物多样性的降低可能会成为多种疾病的诱因, 例如炎症性肠病等[25]。相关研究也证实, 在无菌条件下饲喂的动物肠道组织发育不良, 血管、营养和内分泌功能受到损害, 与正常环境下饲喂的动物相比胃肠道免疫功能较弱, 疾病抵抗力更弱[26,27]。我们认为稻渔共作养殖模式可以给黄颡鱼提供一个更优良的生长环境, 其均匀度更高的肠道微生物也更有利于其生长和对疾病的抵抗。

3.2 肠道微生物组成和相对丰度分析

在门水平上, 变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)占到相对丰度的98%以上, 同时2个养殖模式的优势菌门种类一致。有研究指出黄颡鱼肠道优势菌门是变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门[28,29]。同时在草鱼(Ctenopharyngodon idella)和罗非鱼(Oreochromis niloticus)等鱼类的研究结果也得出一致的结论[30—32]。这些研究结果和本试验得到的结果相一致。虽然不同的养殖模式没有改变黄颡鱼优势菌门的种类, 但是会响其相对丰度, CT组的第一优势菌门是变形菌门, 相对丰度为64.8%, 显著高于DY组的31.2%。而DY组的第一优势菌门是厚壁菌门, 相对丰度为36.7%, 显著高于CT组的10.7%; 第三优势菌门的拟杆菌门相对丰度20.2%, 也显著高于CT组的12.5%。而梭杆菌门在相对丰度上没有差异。导致相对丰度改变的原因可能是2种养殖模式下不同的水体环境和饵料来源等外在因素综合作用的结果。

研究报道指出, 变形菌门丰度的提高可能是肠道菌群失衡的一个重要标志[33]。变形菌门是细菌中最大的一个门, 同时其也包含了大量的病原菌。通过LEfSe分析可知, γ-变形菌纲领单胞菌属在CT组显著富集。沙门氏菌属(Salmonella)(肠炎和伤寒)、耶尔辛氏菌属(Yersinia)(鼠疫)、弧菌属(Vibrio)(霍乱)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等大量致病菌均属于γ-变形菌纲。有研究发现在患病的水生动物体内γ-变形菌纲丰度显著升高[34,35]。邻单胞菌属1种典型的条件致病菌, 常见于鱼类、水生动物和各种哺乳动物消化道内, 与腹泻和食物中毒相关[36]。我们猜测CT组黄颡鱼肠道内机会致病菌的相对丰度可能更高, 受到环境应激等导致内环境紊乱时, 机体对疾病的抵抗力相对更弱。

膳食纤维在肠道内通过发酵作用会产生短链脂肪酸(SCFA), 有研究证实肠道内高SCFA水平与机体的肥胖相关[37]。在肠道菌群中厚壁菌门和拟杆菌门在肠道内也会产生以丁酸盐和丙酸盐为主的SCFA, 厚壁菌门和拟杆菌门的比例被部分研究者认为可以表现人类和其余动物的肥胖程度[38—40]。肥胖机体肠道内厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度的比值(Firmicutes/Bacteroidetes, F/B比值)要更高[41]。厚壁菌门丰度的提高有利于从相同饮食中获取更多能量。在我们的研究中, CT组和DY组的F/B比值分别为0.86和1.82。由于在稻渔共作养殖模式下均没有投喂饲料, 我们推测黄颡鱼可能是捕食养殖水体内丰富的生物饵料, 为了最大效率地利用有限的食物源获取更多能量, 黄颡鱼肠道可能形成以厚壁菌门为主导优势菌群结构。

3.3 肠道微生物表型分析

越来越多的证据表明, 微生物群落的功能组成与环境因子密切相关, 换而言之, 不同的生存环境会影起微生物群落功能的差异[42,43]。在研究肠道微生物群落组成的同时, 尝试使用BugBase揭示不同养殖模式下黄颡鱼肠道微生物的功能轮廓。首先CT组和DY组的优势菌群均是革兰氏阴性菌, 占到相对丰度的70%以上, 鱼类肠道内的优势菌群是革兰氏阴性菌, 同时也存在革兰氏阳性菌[44]。我们的研究结果也和这个结论相一致。但是我们发现,DY组的第一优势菌门——革兰氏阳性菌的厚壁菌门, 其大量繁殖形成优势导致DY组的革兰氏阳性菌比例要显著大于CT组。

从需氧性方面来看, CT组兼性厌氧菌丰富, 而DY组厌氧菌丰富, 在好氧菌方面则无显著差异。肠道菌主要是由厌氧菌、兼性厌氧菌和好氧菌三大类组成, 其中厌氧菌的总数大于好氧菌2—3个数量级[45]。在一般情况下, 专性厌氧菌是优势菌群,厌氧菌和肠黏膜形成的生物保护膜是肠道抵御病原菌的第一道屏障[46]。CT组厌氧菌数量明显低于DY组, 与此同时通过LefSe分析可知DY组厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度较高, 梭菌纲(Class Clostrida)和拟杆菌纲(Class Bacteroidia)富集, 而梭菌纲和拟杆菌纲都是典型的厌氧菌。显著富集于CT组的肠杆菌目(Enterobacteriales)主要是兼性厌氧菌, 兼性厌氧菌多为条件致病菌, 在特定环境下, 会危害宿主的健康。

BugBase还预测CT组肠道微生物中存在潜在致病性, 生物膜形成能力细菌丰度更高。微生物生物膜是由微生物适应生存环境附着于生物(非生物)表面, 被自身分泌的胞外聚合物包裹的高密度微生物群体, 形成生物膜后细菌具有较强的对抗生素能力, 对宿主免疫防御机制的抵抗力也会增强, 生物膜也是细菌引起持续性感染的常见致病机制[47,48]。CT组黄颡鱼肠道微生物不仅潜在致病性更高, 生物膜形成能力更强, 侧面反映出DY组黄颡鱼肠道微生物相对而言更加健康, 稻渔共作养殖模式相较于传统的池塘养殖, 为养殖水产动物提供了一个更为优越的生存环境。

4 结论

本研究从肠道微生物角度探究不同的养殖模式对杂交黄颡鱼肠道微生物的影响, 不同的养殖模式会改变肠道微生物的组成(优势菌相对丰度), 会显著影响黄颡鱼肠道菌群均匀度, 但是没有对其丰富度产生显著影响。相较于池塘养殖模式, 在稻渔共作养殖模式下黄颡鱼拥有更丰富的肠道微生物多样性, 表型预测表明稻渔共作模式下潜在致病力和生物膜形成能力均要显著低于池塘养殖。基于以上结果, 我们认为稻渔共作模式可以给黄颡鱼提供更为优良的生存环境, 其肠道微生物抵御疾病的能力更强。