基于热诱导的绿咖啡油氧化过程解析及活性成分变化规律研究

洪启迪 董文江 梅丽宝 龙宇宙 胡荣锁 初众 王海茹

摘  要：绿咖啡油是一种富含生物活性成分的功能性油脂，贮藏过程中极易氧化酸败影响产品品质。本文以海南地区兴隆咖啡为原料提取绿咖啡油，系统研究在60 ℃加速贮藏36 d内氧化指标、生物活性成分及表征氧化的光谱特征峰变化。结果表明：过氧化值、茴香胺值、硫代巴比妥酸、总氧化值初始值分别为0.97±0.04 meq/kg、4.19±0.14、55.08± 1.98 nmol/mL、8.05±0.06，经过36 d的氧化分别显著升高到28.56±0.15 meq/kg、19.19±0.13、102.38±2.18 nmol/mL、133.43± 0.45。本研究中共鑒定出11种脂肪酸，在绿咖啡油氧化过程中，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸比值由1.14上升至1.49。利用高效液相色谱测定绿咖啡油中的二萜类物质和生育酚，咖啡豆醇、咖啡醇的初始含量分别为21.01±0.31 mg/g、23.44±0.52 mg/g，在氧化24 d后升高至8.21±0.10 mg/g、8.99±0.02 mg/g，随后含量趋于稳定。共定性出α、δ和γ-生育酚，总生育酚含量由初始的49.75±0.88 mg/100 g在氧化18 d达到最大值53.70±1.72 mg/100 g，在氧化结束时降至34.58± 0.05 mg/100 g。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）从特征官能团的角度分析绿咖啡油的氧化过程，油脂在3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164、721 cm–1处有特征吸收峰。采用拉曼光谱技术表征绿咖啡油加速贮藏中的氧化变质，在1000～1800 cm–1波段的峰强度有明显减弱趋势。本研究表明绿咖啡油在热诱导下的贮藏过程中发生了明显的氧化反应，可为提升绿咖啡油贮藏稳定性提供理论参考。

关键词：绿咖啡油;油脂氧化;傅里叶变换红外光谱;拉曼光谱

中图分类号：TS221      文献标识码：A

Abstract： Green coffee oil is a kind of functional oil rich in biologically active ingredients， which is easily oxidized and rancid during storage and affects product quality. In this paper， green coffee oil was extracted from Xinglong coffee in Hainan area， and the changes in the oxidation index， biologically active components and spectral characteristic peaks

that characterize oxidation were systematically studied within 36 days of accelerated storage at 60 ℃. The results

showed that the initial values of peroxide value， anisidine value， thiobarbituric acid and total oxidation value was 0.97±0.04 meq/kg， 4.19±0.14， 55.08±1.98 nmol/mL， 8.05±0.06， respectively. After 36 days of oxidation， it significantly increased to 28.56±0.15 meq/kg， 19.19±0.13， 102.38±2.18 nmol/mL， and 133.43±0.45. A total of 11 fatty acids were identified in this study. During the oxidation of green coffee oil， the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids rose from 1.14 to 1.49. High performance liquid chromatography was used to determine diterpenoids and toco-pherol in green coffee oil. The initial content of cafestol and kahweol was 21.01±0.31 mg/g and 23.44±0.52 mg/g， re-spectively， which increased to 8.21±0.10 mg/g and 8.99±0.02 mg/g after 24 days of oxidation， and then the content tended to be stable. This experiment qualified α， δ and γ-tocopherols. The content of total tocopherols increased from the initial 49.75±0.88 mg/100 g to a maximum value of 53.70±1.72 mg/100 g after 18 days of oxidation， and dropped to 34.58±0.05 mg/100 g at the end of oxidation. Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） was used to analyze the oxidation process of green coffee oil from the perspective of characteristic functional groups. The oil had characteristic absorption peaks at 3008， 2927， 2854， 1745， 1461， 1375， 1238， 1164 and 721 cm–1. Raman spectroscopy was used to characterize the oxidative deterioration of green coffee oil during accelerated storage， and the peak intensity in the 1000–1800 cm–1 band had a significant weakening trend. This study showed that the green coffee oil undergone a significant oxidation reaction during the thermally induced storage process， which can provide a theoretical reference for improving the storage stability of green coffee oil.

Keywords： green coffee oil; lipid oxidation; Fourier transform infrared spectroscopy; Raman spectroscopy

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.035

咖啡为世界三大饮料之一，主要生长在热带和亚热带地区[1]。目前世界范围内有两种被商业开发的品种：阿拉比卡咖啡和罗布斯塔咖啡[2]。2020年度世界咖啡产量比前一年增加700万袋（60 kg），达到1.755亿袋。我国咖啡种植主要集中在云南、海南和四川等地，种植面积达12万 hm2以上，2020年度产量已达到200万袋。咖啡中含有许多活性物质，咖啡醇和咖啡豆醇是两种二萜，主要以脂肪酸酯的形式存在于绿咖啡油中，具有抗氧化、消炎和保护肝脏的作用[3]。生育酚是绿咖啡油中的抗氧化活性成分，可作为抗氧化剂抑制多不饱和脂肪酸的氧化，也有消炎作用[4]。

含有脂质的食物在受热、受光、受氧、受潮或受酶的作用下，可能会酸败或变形，这可能会导致品质下降，甚至可能产生毒物。咖啡中含有10%～15%的脂质，咖啡油主要由三酰甘油（75%）和脂肪酸（18%）组成，脂肪酸的组成与食用植物油相似[5]。目前关于咖啡油的研究较少，Cong等[6]研究了罗布斯塔咖啡在加速贮藏20 d过程中的脂质氧化过程，评价了常规氧化指标和脂肪酸组成，并预测绿咖啡豆的货架期。Williamson等[7]利用核磁共振分析（NMR）结合核磁共振成像（MRI）研究烘焙对咖啡油的影响，其中二萜、氧化水解产物和不饱和脂肪酸是最明显的标志。除咖啡脂质以外，有许多关于其他油脂氧化方面的研究。Tavakoli等[8]研究了杏仁油在加热过程中的氧化稳定性和化学组成，Wang等[9]研究了芫荽精油调味葵花油在加速贮藏24 d下的氧化稳定性。绿咖啡油是一种具有潜在保健价值的新型油脂资源，具有包括抗氧化和癌症预防活性在内的生物学特性。由于绿咖啡油中多不饱和脂肪酸的含量较高，容易发生氧化变质，不仅会产生恶臭，而且会因其降解产物而降低营养质量和安全性，对人体健康产生有害影响。因此，了解绿咖啡油氧化过程中的氧化稳定性和活性物质至关重要。目前尚未有关于绿咖啡油氧化过程中质量特性的文献报道。

在油脂工业中，在常温下进行油脂储藏实验能够真实反映油脂的氧化稳定性，但是这种方法需要耗费很长时间，实际操作性差。Schaal烘箱法通过将油脂储存于60 ℃的烘箱进行加速氧化，间隔相同的时间测定过氧化值以实时监测油脂氧化程度[10]。检测油脂品质除常规分析方法如高效液相色谱法、气相色谱法、气相色谱质谱联用法之外，光谱技术可快速测定油脂品质，其特点是对样品的前处理少且操作简单[11]。史润鸽[12]对不同热氧化时期的牡丹籽油进行红外光谱分析，观察到脂肪酸成分在加热前后有明显变化。张胜来[13]分析了藻油、棕榈仁油和橄榄油氧化过程中的拉曼峰变化情况。

本文采用Schaal烘箱法，将绿咖啡油于60 ℃条件下进行氧化，测定其测定过氧化值（PV）、酸值（AV）、碘值（IV）、茴香胺值（P-AV）、总氧化值（TOTOX）、硫代巴比妥酸（TBARS）、游离脂肪酸（FFA）、共轭二烯（K232）和共轭三烯（K268）和脂肪酸组成。此外，通过高效液相色谱法测定二萜类物质（咖啡醇、咖啡豆醇）和生育酚的含量，利用傅里叶红外光谱和拉曼光谱对绿咖啡油氧化过程中的分子基团信息进行表征。采用主成分分析和相关性分析方法，以融合后的数据集为输入变量，对绿咖啡油在氧化过程中的动态分布、差异分析和相关性进行了研究，解析绿咖啡油加速贮藏氧化过程及活性成分动态变化规律，以期为绿咖啡油贮藏稳定性提升及制定阻控氧化策略提供理论参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  采用海南万宁地区的中粒种罗布斯塔‘热研1号’品种的咖啡鲜果，采摘于中国热带农业科学院香料饮料研究所咖啡试验基地，全红果经低温热泵干燥（40 ℃）干燥后，脱壳、筛分得生咖啡豆。石油醚、二氯甲烷、无水乙醇、氢氧化钾、正己烷、三氟化硼甲醇均为分析纯;甲基叔丁基醚、甲醇、正庚烷为色谱纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;丙二醛（MDA）試剂盒，购于南京建成生物工程研究所。

1.1.2  仪器与设备  R-215旋转蒸发仪，瑞士BUCHI有限公司;7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司;1290超高效液相色谱仪，美国Agilent公司;E2695/W2475高效液相色谱仪，美国Waters公司;Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪，美国Thermo Fisher公司;显微共聚焦拉曼光谱仪，英国Renishaw公司。

1.2  方法

1.2.1  绿咖啡油提取  将生咖啡豆用粉碎机粉碎，过40目筛后准确称量100 g咖啡粉加入500 mL锥形瓶中，加入300 mL石油醚（沸程60～90 ℃），于55 ℃恒温水浴振荡器中提取1 h，滤布过滤，收集滤液。重复提取3次，合并滤液，滤纸过滤后使用真空旋转蒸发仪蒸发溶剂，收集绿咖啡油，并将其转移至30 mL棕色玻璃瓶中，放置于–80 ℃超低温冰箱冷藏备用。

1.2.2  绿咖啡油加速氧化  采用Schaal烘箱加速氧化法，将制备好的绿咖啡油分装于30 mL棕色玻璃瓶中，每瓶20 g，封口后置于60 ℃恒温烘箱贮藏，每隔6 d取样检测，取至36 d[14]。

1.2.3  脂质氧化指标测定  （1）参照国家标准测定过氧化值（PV）（GB/T 5009.227—2016）、酸价（AV）（GB 5009.229—2016）、碘值（IV）（GB/T 5532—2008）、茴香胺值（P-AV）（GB/T 24304—2009）。

（2）游离脂肪酸（FFA）含量测定参考Nhouchi等[15]方法略作修改。准确称取1.00 g的绿咖啡油溶解于20 mL二氯甲烷/乙醇（1∶1，V/V）混合溶液中。滴加2～3滴酚酞作为指示剂，搅拌均匀，用0.1 mol/L氢氧化钾溶液滴定至溶液呈粉红色并持续30 s不褪色。游离脂肪酸含量表示为每克绿咖啡油中KOH的含量（mg/g）。

（3）硫代巴比妥酸（TBARS）采用南京建成生物工程研究所生产的丙二醛（MDA）试剂盒测定。硫代巴比妥酸值表示为每毫升绿咖啡油中MDA的含量（nmol/mL）。

（4）总氧化值（TOTOX）由PV及P-AV计算，公式如下：

TOTOX=4PV+P-AV

其中PV为过氧化值，P-AV为对茴香胺值。

（5）共轭二烯（K232）和共轭三烯（K268）按照国家标准（GB/T 22500—2008）测定。

1.2.4  脂肪酸组成测定  脂肪酸组成参照国家标准（GB/T 5009.168—2016）进行分析。准确称量1.00 g绿咖啡油进行脂肪皂化和脂肪酸甲酯化。利用安捷伦7890A-5975C气质联用仪，配有CP-Sil 88色谱柱（100 m×0.25 mm×0.20 µm）。升温程序：初始温度10 ℃保持13 min，以10 ℃/min增加到180 ℃保持6 min，以1 ℃/min增加到200 ℃保持20 min，然后以4 ℃/min增加到230 ℃保持10.5 min。接口温度和离子源温度均为250 ℃。氦气为载气，流量1 mL/min，进样量2 µL。

1.2.5  二萜类物质（咖啡醇、咖啡豆醇）测定  参考Chartier等[16]方法并稍作修改。称取0.1 g绿咖啡油，加入2 mL 2.5 mol/L氢氧化钾的甲醇溶液，80 ℃水浴1 h进行皂化反应，冷却后加入2 mL去离子水和2 mL甲基叔丁基醚提取不皂化物，混匀并收集上清液，重复提取3次，合并上清液。旋转蒸发浓缩后，加入5 mL正己烷溶解，过0.22 µm滤膜后，采用UPLC-DAD检测。使用安捷伦1290超高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm×100 mm，3.5 μm），流动相为甲醇和水，85%甲醇等梯度洗脱10 min，后运行时间6 min。柱温25 ℃，流速0.7 mL/min，进样量10 μL，DAD检测波长210 nm。将咖啡醇、咖啡豆醇标准品用正己烷配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL标准品溶液，采用UPLC检测，以标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，含量以mg/g表示。

1.2.6  生育酚（α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚）测定  参照国家标准方法（GB/T 26635—2011）对绿咖啡油中生育酚含量进行分析。将0.5 g绿咖啡油溶解在2 mL正己烷中，过0.22 µm有机滤膜。使用沃特世E2695/W2475高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent Zorbax Eclispe Plus C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流动相为甲醇和水，体积比98∶2，流速为1 mL/min。采用UPLC-FLD检测，激发波长（λex）为295 nm，发射波长（λem）为325 nm。将α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品用甲醇配制成100、50、20、10、5、1、0.5 μg/mL标准品溶液，以标准液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，通过标准品溶液的保留时间及标准曲线来对生育酚进行定性和定量，含量以mg/100 g表示。

1.2.7  傅里叶变换红外光谱分析  使用傅里叶变换红外光谱仪（Thermo Fisher，美国）监测分析绿咖啡油氧化过程中谱峰的变化趋势。将干燥后的光谱纯溴化钾充分研磨后用压片机压成透明薄片，扫描后作为背景。用移液枪准确移取0.5 μL绿咖啡油滴在溴化钾压片上，待形成一层均匀液膜后进行扫描，测定扫描范围为4000～400 cm–1，扫描次数为32次，分辨率为1 cm–1。利用OMNIC软件对光谱进行平滑和基线校正处理，光谱数据输出格式为吸光度。

1.2.8  拉曼光谱分析  拉曼光谱作为新兴的检测油脂氧化的分析手段有操作简便、灵敏度高、样品用量少的优点，使用拉曼光谱对绿咖啡油氧化过程中分子結构变化进行监测。参考林新月等[17]方法并稍作修改，显微共聚焦拉曼光谱仪（Renishaw，英国）选用785 nm的激光光源，物镜使用5倍焦距镜头，准确移取10 μL绿咖啡油滴在用锡箔纸包裹的载玻片上，将其置于显微共聚焦拉曼光谱仪载物台的物镜视野下并找到合适的位置，调整焦距至清晰可见，设置扫描参数为光栅600 mm–1，积分时间为15 s，扫描次数为1次，扫描范围设为200～3300 cm–1，扫描后对拉曼谱峰进行基线扣除。

1.3  数据处理

采用Microsoft Excel 2019软件进行数据的整理与计算;在SPSS 22.0软件上采用Ducan’s法进行一元方差方差分析（ANOVA）;使用Origin 2021软件进行Pearson相关性分析及主成分分析（PCA）。实验均重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2  结果与分析

2.1  绿咖啡油氧化指标分析

2.1.1  不同氧化时间对过氧化值、酸价、游离脂肪酸的影响  过氧化值（PV）用于通过测量油氧化降解形成的初级氧化产物（过氧化物）来确定油的质量，决定了油的稳定性。PV是绿咖啡油氧化酸败的重要指标，反映了初级水平的脂质氧化程度。如图1A所示，样品的PV随氧化时间的延长几乎呈指数型增长。绿咖啡油的初始PV为0.97±0.04 meq/kg，经过36 d的氧化，PV增加到28.56±0.15 meq/kg。在氧化过程中，咖啡油样品的PV越高，说明其氧化酸败程度越高。初始阶段PV增加可能是由于自由基对不饱和脂肪酸的影响和过氧化物的形成，由于过氧化物性质不稳定，会分解成二次氧化产物（醛、酮等）[18]。

酸价（AV）可作为油脂质量劣变的指标，其决定了甘油三酯水解产生的游离脂肪酸的数量。在光、热或脂肪酶的作用下，脂质分子释放出游离脂肪酸，这会影响油脂的稳定性。绿咖啡油在氧化过程中AV变化如图1B所示，AV随时间延长呈上升趋势，从1.75±0.08 mg/g（0 d）增加到2.64± 0.06 mg/g（36 d），6 d到12 d与18 d到24 d的AV无显著差异，在氧化后期，样品AV变化速率较前期更快，说明油脂水解酸败程度更高。在食用植物油国家标准中，植物原油的AV须低于4 mg/g。

游离脂肪酸（FFA）被用于测定油脂中甘油三酯水解情况。当甘油三酯分解，游离脂肪酸浓度增加时，促进了油脂的氧化过程，从而缩短了油脂的储存期。如图1C所示，游离脂肪酸初始含量为1.47±0.08 mg/g。所有样品的游离脂肪酸含量在氧化36 d内均有增加，在氧化的中期12 d到24 d之间无显著变化，氧化终点的FFA为2.28±0.05 mg/g，说明绿咖啡油在氧化的过程中发生了水解。氧化过程中FFA的形成影响了油的AV，因此，AV和FFA含量呈极显著正相关。

2.1.2  不同氧化时间对茴香胺值、硫代巴比妥酸值、碘值的影响  茴香胺值（P-AV）能评估油脂次级氧化，醛羰基键在脂质次级氧化过程中形成。在本研究中，如图2A所示。氧化初期P-AV为4.19±0.14，加速氧化6 d后，P-AV降到2.83±0.20，原因是在氧化初期并没有发生次级氧化反应，在随后氧化的30 d升高到19.19±0.13，说明绿咖啡油的氧化程度随时间的延长而升高，产生较多的醛酮类物质导致P-AV上升。

硫代巴比妥酸（TBARS）主要用于评估氧化的次级产物（如醛和酮）的形成，这些产物主要来源于多不饱和脂肪酸的降解。过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸缩合，因而测试MDA的量可以反应油脂过氧化程度。食品中TBARS越高，代表食品越不新鲜。如图2B所示，在氧化初期，TBARS为55.08±10.98 nmol/mL，

氧化中期即12～30 d，TBARS升高较为平缓，由77.62±1.26 nmol/mL升高至85.87±1.20 nmol/mL。油樣在氧化末期快速升高到102.38±2.18 nmol/mL，表明在氧化末期，绿咖啡油产生的醛类物质较多，次级氧化反应加快。

碘值（IV）可用于测定脂肪酸的不饱和程度，样品中IV与不饱和双键呈正相关，IV越高，不饱和脂肪酸含量越高。图2C所示，在氧化的36 d内，碘值呈线性趋势降低，由73.67±0.55 g/g逐渐下降至55.51±0.58 g/g。这种下降主要是由于脂肪氧化引起脂肪酸双键破坏，不饱和双键减少，不饱和脂肪酸含量降低。也有其他学者通过IV来反映油脂氧化程度，夏义苗等[19]在葵花籽油品质的研究中，在180 ℃加热条件下，24 h内随时间的延长，碘值迅速降低，氧化程度升高，不饱和键快速减少。

2.1.3  不同氧化时间对总氧化值的影响  总氧化值（TOTOX）由茴香胺值和过氧化值计算得来，它综合了初级和次级氧化程度的信息，能评估油脂的总体氧化状态。图3所示为TOTOX值的变化趋势，与过氧化值的变化趋势相似，即绿咖啡油的TOTOX值在氧化期间呈指数型升高。TOTOX初始值为8.05±0.06，0～6 d油样无显著变化，在24～30 d的TOTOX升高速率最快，经过36 d的加速氧化，TOTOX增加到133.43±0.48。这些结果表明，氧化过程促进了初级和次级氧化产物的生成，从而降低绿咖啡油的氧化稳定性。TOTOX结合了初级化产物（氢过氧化物）与次级氧化产物（不饱和醛类）的指标，更能全面的评价油脂氧化劣变程度。

2.1.4  不同氧化时间对共轭二烯、三烯的影响  共轭二烯（K232）是在油脂发生氧化反应时由多不饱和脂质产生的十八碳二烯氢过氧化物，通过在波长为232 nm处的最大吸收峰进行定量测定。在波长268 nm处的吸光度能够反映绿咖啡油氧化过程中次级氧化产物共轭三烯（K268）的多少[20]。从图4A可以看出，K232值在0～12 d中无明显变化，在12 d后开始升高，在36 d达到最大值。加速氧化对K268值的影响如图4B所示，在36 d的氧化过程中，K268值在6 d时由0.26降低到0.22，最终增加到0.29，此现象能与茴香胺值在氧化6 d后降低相对应，表明在氧化初期并没有生成次级氧化产物，在氧化后期次级氧化产物增加。

2.2  脂肪酸组成变化

如表1所示，本研究中共鉴定出11种脂肪酸：十五烷酸（C15∶0）、棕榈酸（C16∶0）、十七烷酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亚油酸（C18∶2）、α-亚麻酸（C18∶3）、花生酸（C20∶0）、二十烷酸（C20∶1）、二十碳二烯酸（C20∶2）和二十一烷酸（C21∶0）。

如图5A，样品主要的脂肪酸为棕榈酸（29.42%～26.64%）、硬脂酸（15.12%～20.65%）、油酸（10.53%～12.88%）和亚油酸（33.86%～ 26.40%），这是与本课题组前期研究结果一致[21]。在咖啡油氧化过程中，饱和脂肪酸（SFA）含量由53.30%上升至59.89%，不饱和脂肪酸（UFA）由46.70%降至40.11%（图5B），导致SFA/UFA由1.14上升至1.49，这种现象是由于UFA水解和氧化产生的影响，与前文碘值下降的结果相印证。本研究中，油脂氧化过程中多不饱和脂肪酸（PUFA）含量存在显著差异，在氧化过程中有明显的下降。这可能是因为PUFA在氧化过程中不稳定，受温度及时间影响而发生裂变、聚合等反应而氧化生成单不饱和脂肪酸（MUFA）和SFA，从而导致绿咖啡油中MUFA和SFA的含量随氧化时间的延长而不断增加。MUFA是最稳定的不饱和脂肪酸，MUFA与SFA的比率与健康特性相关，这是因为MUFA（主要是油酸）能够降低血液中有害胆固醇（LDL）的水平，提高人体中的高密度脂蛋白（HDL）水平[8]。

2.3  二萜及生育酚含量分析

关于咖啡醇和咖啡豆醇的研究表明，咖啡醇和咖啡豆醇具有抗氧化、消炎和保护肝脏的作用，它们是咖啡脂质组分物质中特有的二萜类物质，对健康有积极的作用[22]，其含量如表2所示。咖啡豆醇与咖啡醇在氧化过程中均有上升的趋势。咖啡豆醇含量由氧化初期的21.01±0.31 mg/g在氧化24 d时升高到23.44±0.52 mg/g，在之后的氧化过程中无显著变化，油样在30 d、36 d的咖啡豆醇含量分别为23.78±0.27 mg/g、23.69±0.19 mg/g。咖啡醇的变化趋势与咖啡豆醇相同，含量由8.21±0.10 mg/g（0 d）升高到8.99±0.02 mg/g（24 d）后趋于稳定。

生育酚是植物油中一种重要的天然抗氧化剂，它不仅能阻断自由基的产生，还能抑制单线态氧的产生，对植物油多不饱和脂肪酸氧化变质具有保护作用[23]。本研究共定性出3种生育酚，分别为α、δ和γ-生育酚。3种生育酚的抗氧化能力为：α-生育酚>γ-生育酚>δ-生育酚。本研究中γ-生育酚是绿咖啡油中的主要生育酚，占咖啡油生育酚总量的64.08%～76.34%，含量在26.40± 0.37 mg/100 g～33.19±0.47 mg/100 g，其次为α-生育酚、γ-生育酚。3种生育酚含量在氧化过程中均呈现出先上升后下降的变化趋势，均在氧化18 d时达到最大值，因此在氧化后期，由于生育酚含量的减少，绿咖啡油的抗氧化能力随之减弱。

2.4  傅里叶红外光谱分析

绿咖啡油在波段为4000～400 cm–1范围内红外光谱图如图6A所示，从图中可看出，油脂的光谱在波段3008、2927、2854、1745、1461、1375、1238、1164和721 cm–1处有吸收峰，这些谱峰与油脂化学结构中存在的官能团有关，揭示了组分的特征[24]。不同氧化时间下的谱峰的强度存在变化，这些变化是由于绿咖啡油氧化过程中生成了氢过氧化物、醛、酮、游离脂肪酸等氧化产物，因此，可采用红外光谱从特征官能团的角度分析绿咖啡油的氧化过程。

波段721 cm–1处是顺式取代烯烃的CH2伸缩振动与平面外振动的重疊峰，如图6B所示，峰强度随时间的延长而降低，表明氧化过程中，油脂分子链断裂，分子量变小。1164 cm–1处为酯基团（-C-O）伸缩振动，在氧化过程中吸收峰变窄，1461 cm–1处为亚甲基（-CH2）弯曲振动，峰强随时间增长有轻微下降（图6C）。1746 cm–1为甘油三酯羰基（-C=O）伸缩振动峰，此处的吸收峰最强，此峰峰强随着氧化时间的延长而增加，这是由于油脂氧化过程中生成醛、酮、酸等物质使官能团增加而引起的（图6D）。2854 cm–1处为甲基（-CH3）对称伸缩振动，2927 cm–1处为亚甲基（-CH2）不对称伸缩振动，两者在氧化过程中吸收峰强度增强（图6E）。3008 cm–1处为油脂烯烃不饱和C原子上C-H伸缩振动，吸收峰在氧化过程中下降，此处吸收峰强度与油脂不饱和脂肪酸（亚油酸和亚麻酸）含量相关，说明不饱和脂肪酸含量下降。通过红外光谱分析绿咖啡油在氧化过程中谱图的变化，能说明特征官能团吸收峰每一个微小的变化都反映了油脂内部的改变。

2.5  拉曼光谱分析

利用拉曼光谱可以监测脂质氧化过程中分子结构变化。图7所示为绿咖啡油氧化过程中的拉曼光谱图，从图中可看出各峰所代表的组分分子基团结构信息。油脂中的每一种分子基团都能跟某种具有拉曼活性的振动方式相匹配，从而相应地在拉曼光谱中形成一个特征峰，并且该特征峰的强度随着该分子基团浓度的增加或降低而增强或减弱，即两者成正比关系。由图7A可知，绿咖啡油氧化过程中，拉曼光谱的变化大多数集中在1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1区域，特别是1000～1800 cm–1区域。在1082、1265、1442、1658、1745、2850 cm−1区域观察到拉曼强度的变化。在整个氧化过程中，咖啡油的拉曼光谱强度均呈减弱趋势，说明基团发生了变化。1082 cm–1处的峰强与不饱和度呈正相关，此处峰强降低代表了脂肪酸不饱和程度降低（表3）。1265 cm–1和1658 cm–1处峰强减弱，是由于在油脂氧化的过程中，随着氧化程度的加深，顺式双键发生异构化并重排成为稳定的反式双键构型的趋势越来越强烈，即在反式结构成分持续增多的同时，顺式结构普遍减少[17]。

标准正态变量变换（SNV）主要是用以消除固体颗粒大小、表面散射以及光程变化对光谱的影响。一阶导数可消除光谱中基线的平移和漂移，可有效消除其他背景的干扰，分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度[25]。图7B是将原光谱图进行SNV和一阶导数预处理后的结果，能清晰观察到1000～1800 cm–1和2800～3050 cm–1区域拉曼强度随氧化时间的增长而减弱。

2.6  主成分分析

主成分分析（PCA）是一种把多个指标转化为少数几个综合指标的分析方法，目的是简化数据和揭示变量之间的关系[26]。用PCA分析了绿咖啡油各氧化指标、活性物质、脂肪酸与氧化时间的关系。如图8所示，第一主成分（PC1）贡献率为87.1%，第二主成分（PC2）贡献率为7.2%，累计贡献率为94.3%，表明前两个主成分可解析原始变量94.3%的信息。图8A显示了样品的二维得分投影图（PC1-PC2），根据样品特征对不同氧化时间的样品进行分类。显然，不同氧化时间下的绿咖啡油在得分图的四个象限很容易区分，氧化中期（18 d～24 d）的绿咖啡油样品有轻微重叠。每个主成分都是原始变量的线性组合，线性组合中各变量对主成分的影响用载荷表示，载荷绝对值越大，其影响越大，各指标的载荷如图8B所示。PC1中，酸价、过氧化值、总氧化值的载荷绝对值最大，均为0.28，说明这三个指标对PC1起决定性作用。PC2中，咖啡醇与K268的载荷绝对值最大，分别为0.44、0.43，表明这两个指标是PC2的代表指标。氧化0 d的绿咖啡油与其他样品区分开的主要影响指标是不饱和脂肪酸和碘值。PCA结果表明，各氧化时间下的绿咖啡油可根据不同指标进行聚类。此外，部分样品氧化时间的分组较为紧密，这可能是二萜类和生育酚指标相似的结果。

2.7  相关性分析

为进一步探究绿咖啡油氧化过程中各指标间相关性，对其进行了Pearson相关性分析，如图9所示为绿咖啡油不同氧化阶段各氧化指标、生育酚、二萜、脂肪酸之间的关系。上三角区红色椭圆表示二者呈正相关，蓝色椭圆表示二者呈负相关，椭圆越扁颜色越深表明相关性越大，无星号标记表明二者无相关性;下三角区则标明了相关系数。过氧化值与酸价、游离脂肪酸、茴香胺值、总氧化值、共轭二烯、饱和脂肪酸呈极显著正相关（P<0.01），这些指标都随氧化时间的增长而升高;过氧化值与碘值、总生育酚、不饱和脂肪酸呈极显著负相关。咖啡醇、咖啡豆醇与多个指标无相关性，表明脂质氧化对绿咖啡油中二萜类成分影响不大。由此可进一步说明在绿咖啡油氧化过程中，其品质变化与脂质氧化降解密切相关，各指标的变化有明显的对应关系。

3  讨论

油脂氧化的途径有自动氧化、光敏氧化和酶促氧化。绿咖啡油贮藏过程中主要发生自动氧化，油脂氧化过度会导致感官分值降低、风味劣化、营养价值流失等一系列损害。不少学者通过热诱导加速氧化法对油脂进行氧化处理，Li等[27]描述了加速氧化对大豆油颜色变化的影响，讨论了返色与氧化之间的定量关系。Rotich等[28]对4种意大利特级初榨橄榄油的热氧化稳定性进行了研究。

绿咖啡油中共检测出11种脂肪酸，随着油脂氧化，SFA和MUFA含量升高，SFA与USFA比值增大，这是由于PUFA在氧化过程中发生了裂变与降解。碘值降低、傅里叶红外光谱中3008 cm–1处吸收峰强度降低和拉曼光谱中1082 cm–1处的峰强降低同时表征了USFA在氧化过程中含量减少的信息。此结果与Cui等[29]研究冷榨榛子油在加速氧化40 d过程中氧化特性、脂肪酸及主要生物活性物质的变化规律一致。

绿咖啡有中含有丰富的活性物质，本研究中测定的生育酚是常见的天然抗氧化剂，且存在多种构型。3种生育酚在加速氧化18 d后均呈下降趋势，且α-生育酚减少59.11%，消耗最多且最快，其原因是α-生育酚生理活性在生育酚同系物中最强，更容易氧化降解。尽管绿咖啡油中存在一定的抗氧化物质，但仅能减缓而不能阻止油脂在热诱导下的加速氧化，因此，不少学者通过添加抗氧化剂来增强油脂的抗氧化能力。Martin-Rubio等[30]研究了添加质量分数为0.002%～5%的α-生育酚对大豆油氧化稳定性的影响。Zhao等[31]研究了米糠油热氧化过程中谷维素和生育酚最佳配比的添加及其与米糠油理化指标的关系，说明天然抗氧化剂对油脂的稳定性和营养特性十分重要。

4  结论

（1）热处理会促进绿咖啡油的氧化，氧化程度越高，绿咖啡油品质越差。

（2）绿咖啡油中的活性物质咖啡豆醇、咖啡醇含量在氧化过程中均有上升，生育酚含量均呈先上升后下降的趋势。

（3）绿咖啡油的红外光谱分析结果表明氧化过程中的分子基团发生了变化，拉曼光谱谱图中代表不饱和脂肪酸的基团峰强下降明显。

（4）本研究为评判绿咖啡油加速氧化过程汇总品质变化提供了多个典型理化指标信息，不仅为利用综合指标來评判油脂品质提供了有益思路，亦为绿咖啡油贮藏稳定性提升及制定阻控策略提供了参考。

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責任编辑：崔丽虹