带叶兜兰成花过程中叶片内源激素与多胺含量的变化动态

李秀玲 范继征 廖宏英 何荆洲 曾艳华 龙蔷宇 卜朝阳

摘  要：近些年兜兰产业发展迅速，但花期调控难成为限制兜兰产业发展的瓶颈。以带叶兜兰为试验材料，采用高效液相色谱分析的方法，研究带叶兜兰开花期间叶片中内源激素及多胺含量的变化规律，分析内源激素及多胺对其开花的影响。结果表明，高水平的ZT、IAA、GA3、多胺含量和GA3/IAA比值有利于带叶兜兰花芽分化;带叶兜兰花朵形态建成需要更高水平的ZT、IAA、GA3、多胺含量和Spd/Put、Spm/Put比值;带叶兜兰叶片GA3具有调控IAA水平和Put水平的作用，多胺和激素之间存在密切的关系。

关键词：带叶兜兰;叶片;内源激素;多胺;开花

中图分类号：S682.31      文献标识码：A

Abstract： The Paphiopedilum orchid industry has developed rapidly recently. However， flowering regulation has become the bottleneck restricting the development of the industry. P. hirsutissimum， which is easy to bloom， was used as the experiment materials， the content changes of endogenous hormones and polyamine in functional leaves were detected by high performance liquid chromatography （HPLC） to provide a theoretical basis for the flowering regulation of the orchids. High content of ZT， IAA， GA3， PAs and high ratio of GA3/IAA in leaves were beneficial to inducing the bud differentiation. Higher content of ZT， IAA， GA3， PAs and high ratio of Spd/Put， Spm/Put in leaves were beneficial to floral morphological differentiation. GA3 could regulate IAA and Put levels， there was a close relationship between polyamines and hormones.

Keywords： Paphiopedilum hirsutissimum; leaves; endogenous hormone; polyamine ; flowering

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.024

带叶兜兰[Paphiopedilum hirsutissimum （ Lindl. Ex Hook） Stein]又名富宁兜兰，是兰科杓兰亚科兜兰属植物，因其花型优美、叶片形似条带而得名。带葉兜兰野外花期4—5月，其花大色艳，具有独特的观赏价值[1-2]，目前园艺学家已掌握了其非共生萌发繁育技术[3-4]，以其为亲本也获得了较多的杂交后代[5]。但是兜兰属植物存在开花不整齐、花期不一致、开花率低等花期调控难的产业瓶颈[6]，而带叶兜兰具有较强的适应性，是兜兰属中较易驯化和栽培的种类，在迁移地南宁长势较好，也较易开花[7]，可作为野生兜兰商品化、规模化繁育的旗舰物种。激素和多胺在很多植物上已被证实在花芽分化的进程中起着至关重要的作用[8-12]，杨丽等[13]在菊花中研究发现，菊花花芽分化过程中，腐胺（Put）含量的降低有利于启动菊花花芽分化，后期精胺（Spm）的增加有利于小花的分化，叶片可能向顶芽提供Spm，顶芽和叶片中的亚精胺（Spd）与小花原基分化有密切关系;李茹等[14]研究发现，在铁皮石斛无根组培苗培养基中添加适量的Put和Spm可提高开花率;曾新萍等[15]对蝴蝶兰成花过程中叶片内源激素与多胺含量的变化动态进行了研究，发现内源多胺与激素含量动态具有关联效应，但它们在兜兰属植物的花芽分化及发育进程中的含量及其与花发育历程的关系尚未见相关报道。为此，本研究以具有广西特色的带叶兜兰为试验材料，摸索其花芽分化和发育过程中内源激素和多胺的变化规律，以期为兜兰属植物的花期调控提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

选取生长健康、无病虫害的野生带叶兜兰植株，分S1大苗期、S2现葶期、S3花苞显现期、S4初花期、S5盛花期、S6凋花期等共6个时期（图1）。取材时，用干净纱布擦去表面尘土，用液氮速冻保存于超低温冰箱中备用。

1.2  方法

采用高效液相色谱法（HPLC- MS）[16]提取并测定内源激赤霉素（GA3）、生长素（IAA）和玉米素（ZT）含量，参照刘俊等[17]的高效液相色谱法测定腐胺（Put）、精胺（Spm）和亚精胺（Spd）含量。每个时期样品随机采取3个生物学重复。内源激素和多胺均采用外标法定量计算，通过标样计算样品中多胺和激素的浓度，计算单位质量鲜样中的多胺和激素的含量，单位均为μg/g。

1.3  数据处理

数据采用Excel 2003软件处理，差异比较采用SPSS 16.0邓肯新复极差法（SSR法）。

2  结果与分析

2.1  带叶兜兰叶片内源激素及内源多胺含量的变化

2.1.1  玉米素（ZT）  由图2A可知，在大苗期至花期内，ZT含量表现为先上升后下降的趋势。大苗期ZT含量略高于现葶期，但二者呈极显著差异（P<0.01），从现葶期至初花期ZT含量直线上升，初花期上升至最高值19.83 μg/g，盛花期ZT含量略低于初花期，凋花期叶片ZT含量急剧下降至8.44 μg/g，6个时期ZT含量均呈显著差异（P<0.05）。

2.1.2  赤霉素（GA3）  由图2B可知，带叶兜兰叶片赤霉素（GA3）含量在大苗期呈最低，为6.19 μg/g，与其他时期GA3含量差异极显著（P<0.01）;而在初花期达到最高值（65.94 μg/g），盛花期至凋花期GA3含量呈直线下降趋势，6个时期GA3含量均呈极显著差异（P<0.01）。

2.1.3  生长素（IAA）  由图2C可知，叶片IAA含量变化较大，呈现先上升后下降的趋势。大苗期、现葶期、花苞显现期和凋花期IAA含量较低，在凋花期叶片IAA含量达到最低值（3.48 μg/g），与其他时期IAA含量均呈极显著差异（P<0.01）。初花期和盛花期的叶片IAA含量具有较高水平，约为凋花期的16倍，与其他时期叶片IAA含量呈极显著差异（P<0.01），但是初花期和盛花期IAA含量差异不显著，基本持平。

2.1.4  腐胺（Put）  由图2D可知，带叶兜兰叶片Put含量呈先上升后下降的趋势，Put含量在花苞显现期呈现最高水平（193.93 μg/g），与其他时期均呈极显著差异（P<0.01）。初花期时急剧下降至50.02 μg/g，与大苗期、现葶期、花苞显现期均呈极显著差异（P<0.01），与之后的盛花期和凋花期呈显著差异（P<0.05）;与初花期相比，盛花期和凋花期叶片Put含量略有上升，但数值变化不大，二者之间无明显差异。

2.1.5  亚精胺（Spd）  由图2E可知，带叶兜兰叶片Spd含量大致呈先上升后下降的趋势，大苗期至花苞显现期Spd含量上升，至花苞显现期出现峰值（96.54 μg/g）;初花期、盛花期和凋花期Spd含量逐渐下降，至凋花期亚精胺含量降至最低为19.59 μg/g;6个时期Spd含量均呈极显著差异（P<0.01）。叶片Spd含量的变化趋势同Put含量变化趋势比较相似。

2.1.6  精胺（Spm）  由图2F可知，带叶兜兰叶片Spm含量大致呈先上升后下降的趋势，在初花期Spm含量达到峰值（5.94 μg/g），与盛花期Spm含量差异不显著，但与其他时期均呈极显著差异（P<0.01）。从大苗期至初花期Spd含量呈逐渐上升趋势，现葶期与花苞显现期Spm含量差异不显著，但是与大苗期呈极显著差异（P<0.01）;凋花期Spm含量降低为3.39 μg/g，与大苗期持平，二者之间无显著差异。

2.2  带叶兜兰叶片内源激素、内源多胺含量比值的变化

2.2.1  ZT/GA3比值的变化  由图3A可知，带叶兜兰叶片ZT/GA3的比值大致呈先下降后上升然后再下降的趋势，其中以大苗期ZT/GA3的比值最高（1.27），與其他时期均呈极显著差异（P<0.01），之后在现葶期（0.18）急剧下降，又在花苞显现期上升，之后呈逐渐下降的趋势。由此可见大苗期ZT/GA3的比值很高以促进细胞分裂加快生长，而在花苞显现期叶片ZT/GA3的比值较高以促进花朵正常绽放，凋花期二者比值较低，加速了脱落和衰老。

2.2.2  GA3/IAA比值的变化  由图3B可知，GA3/IAA比值大致呈先上升后下降然后再急剧上升的趋势，两次峰值分别出现在现葶期（3.82）和凋花期（13.02），二者之间呈极显著差异（P<0.01），两次谷值分别出现在大苗期（0.96）和盛花期（1.14），二者之间差异不显著。这充分说明大苗期GA3/IAA比值较低以促进生长，现葶期比值增大，以促进花芽分化，而在盛花期GA3含量和IAA含量基本持平，维持生长发育;凋花期较高的GA3/IAA比值说明IAA的急剧下降加速了衰老和花朵脱落。

2.2.3  ZT/IAA比值的变化  由图3C可知，在带叶兜兰花期内ZR/IAA的比值变化较大，略呈“W”型变化趋势，大苗期、花苞显现期、凋花期出现3次峰值，其值分别为1.21、1.36和2.48，凋花期ZR/IAA比值最高，和其他时期均呈显著差异（P<0.01），大苗期和花苞显现期ZR/IAA的比值差异不显著。现葶期和盛花期出现谷值，其值分别为0.67和0.36，初花期和盛花期ZR/IAA的比值变化不大，3个时期的比值差异不显著。

2.2.4  Spd/Put比值的变化  由图3D可知，Spd/Put的比值大致呈先上升后下降的趋势，大苗期和花苞显现期Spd/Put比值差异不显著，到初花期Spd/Put的比值达到顶峰（1.28），与其他时期均呈极显著差异（P<0.01）;在之后的盛花期、凋花期Spd/Put比值急剧下降，至凋花期下降至0.36，为整个花期的最低值，与其他时期均呈极显著差异（P<0.01）。

2.2.5  Spm/Put比值的变化  由图3E可知，带叶兜兰叶片Spm/Put比值大致呈先上升后下降的趋势，花苞显现期Spm/Put比值最低（0.02），之后在初花期达到峰值（0.12），凋花期下降至0.06，除大苗期和现葶期二者之间无显著差异外，其他时期之间均呈极显著差异（P<0.01），这和Spd/Put比值变化趋势基本一致。

3  讨论

高等植物从营养生长向生殖生长的转变过程是多种因素共同作用的结果[18]，其中激素及多胺发挥了重要的调控作用[12， 19]。激素和多胺都是植物自身代谢产生的微量有机分子，在调控生长、发育、衰老和抗逆等方面发挥重要作用。多胺常被认为是植物生长调节物质或植物激素的第二信使[20-22]，能促进花芽分化，特别是腐胺和亚精胺。植物成花调控不仅受外界环境因子影响，而且植物体内的各种激素存在互相协同和拮抗作用，是一个复杂的调控过程。植物激素调控是植物感受外部环境变化信号，利用多种激素的协同或拮抗的作用调整自身的生长和分化进程，增强对环境适应能力的调控方式[23]。

兜兰生产过程中存在着开花不整齐、花期不一致、开花率低等花期调控技术瓶颈，严重制约了兜兰产业的快速发展。我国虽然具有较多的野生兜兰资源，但是由于其种类、栽培地区的不同而表现出较大的生长差异，为兜兰标准化生产增加了难度[6]。有关兜兰花期调控的研究较少，陈影[6]摸索了施肥和生长调节剂对魔帝兜兰开花的影响，结果并不理想;皮秋霞等[24]通过形态解剖研究了杏黄兜兰花的发育过程，发现在云南野外条件下8月底至9月初是杏黄兜兰进行花器官形态分化的关键时期;郑勇平等[25]对‘魔帝’兜兰和‘肉饼’兜兰的催花技术进行了报道。但是关于激素和多胺对兜兰花芽分化及成花过程的关系尚未见报道。

本文以带叶兜兰为试验材料，研究其自然条件下花芽分化过程中内源激素、多胺含量以及激素间比值的变化，结果发现：

（1）带叶兜兰从现葶期至初花期叶片ZT含量呈上升趋势，这说明叶片ZT含量不断升高以利于花朵绽放，表现出对成花的促进作用;而在花朵凋谢的花末期叶片ZT含量急剧下降，以调控花朵凋零。

（2）带叶兜兰大苗期、现葶期和花苞显现期IAA含量较低，初花期IAA含量急剧增加，并在盛花期基本保持稳定，凋花期急剧下降，这说明带叶兜兰花芽分化前期不需要太多的IAA，花朵盛开时期需要较高水平的IAA以维持花朵绽放。

（3）带叶兜兰现葶期GA3含量增加，而在初花期达到最高值，说明GA3含量适量增加促进带叶兜兰由营养生长向开花转变。GA3含量在初花期达到峰值，说明功能叶开始大量分泌赤霉素，加速花朵凋落，GA3对花朵的调控有延迟性。GA3的变化趋势和IAA变化趋势大致一致，这也进一步印证了GA3具有调控IAA水平的作用。

（4）带叶兜兰叶片Put和Spd含量均呈先上升后下降的趋势，均在花苞显现期呈现最高值，这说明功能叶片中PAs含量升高，有利于花芽分化的启动，花芽形态分化期可能需要更高水平的PAs含量，以供应花朵形态建成需要较多的多胺物质，这和低温胁迫对建兰叶片内源多胺含量影响的研究[26]一致，即在开花前期积累提高多胺的总含量，通过调控Spd、Put和Spm含量，达到新的平衡状态，以此调控花芽的发育。Spm含量变化趋势和ZT含量变化趋势基本一致。

（5）在激素比值以及多胺比值分析中发现，顶芽从营养生长向生殖生长转换的现葶期，具有较低比值的ZT/IAA、ZT/GA3、Spd/Put和Spm/Put和高比值的GA3/IAA;成花形态分化的花苞显现期，具有高比值的ZT/IAA、ZT/GA3和低比值的GA3/IAA、Spd/Put、Spm/Put。而在初花期激素和多胺间的配比又发生了很大的变化，呈现高比值的Spd/Put、Spm/Put和低比值的ZT/IAA、ZT/GA3、GA3/IAA，这说明不同激素比值和多胺比值在随着时间或环境等方面的因素变化较大。

IAA含量（浓度）高低对花芽分化中的作用一直颇有争议[27-28]。本研究发现带叶兜兰花芽分化前期不需要太多的IAA，花朵盛开时期需要较高水平的IAA以维持花朵绽放，同时研究也发现在带叶兜兰花发育时期内，GA3具有调控IAA水平的作用。但是能够保持兜兰花芽正常分化以及花朵形态建成等各阶段适宜的IAA浓度又是什么范围？还有待进一步研究。

众多研究发现，多胺和植物激素间存在着密切的关系[29-31]。Alcázar等[21]研究发现Put的积累可能会抑制GA3的合成，从本研究来看，Put和GA3确实存在此消彼长的变化趋势;Spm含量变化趋势和ZT含量变化趋势基本一致;但是有关Put和GA3、Spm和ZT在带叶兜兰内的相互作用机制有待进一步研究。

本研究发现，高水平的ZT、IAA、GA3、多胺含量和GA3/IAA比值有利于帶叶兜兰花芽分化;带叶兜兰花朵形态建成需要更高水平的ZT、IAA、GA3、多胺含量和Spd/Put、Spm/Put比值。有待进一步结合叶芽、花芽分化及形态建成的显微解剖结构明确激素和多胺对兜兰花芽分化及形态建成的影响。

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责任编辑：沈德发