狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定

郭静远 赵辉 屈静 张丽丽 郭安平

摘  要：狗尾草是重要的模式植物，是研究C4光合作用的优秀模型，具有热带植物的典型特征。U6启动子主要用于构建RNAi和CRISPR表达载体，有启动干扰发夹结构的表达和基因编辑引导序列复合结构的表达的作用，该启动子具有特殊的启动位点G，能够保证转录后RNA结构的完整性。随着CRISPR 技术的发展，利用狗尾草进行基因编辑的研究日益增多和深入，目前还没有针对狗尾草U6启动子的克隆及功能鉴定。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或亲缘物种的U6启动子能取得更高的的启动效率，本研究克隆了狗尾草2个U6启动子基因，并构建不同序列长度的U6启动子序列驱动GUS基因的表达，GUS融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤，瞬时表达验证表明，克隆出的2个狗尾草 U6启动子在狗尾草上具有很强的启动效率;并且将该载体转化狗尾草后，获得了能够稳定表达GUS基因的转基因植株;将该U6启动子用于构建狗尾草PDS基因CRISPR编辑载体，获得能够稳定表达的白化苗，说明克隆的狗尾草U6启动子能够很好的启动基因编辑载体的转录。

关键词：狗尾草;U6启动子;CRISPR系统;RNA干扰

中图分类号：Q949.748.5      文献标识码：A

Abstract： Setaria viridis is an important model plant and an excellent model for C4 photosynthesis， which has typical characteristics of tropical plants. U6 promoter is mainly used to construct RNAi and CRISPR expression vectors. It has the function of initiating the expression of the interference hairpin structure and the expression of the compound struc-ture of the gene editing guide sequence. The promoter has a special start site G， which can ensure the integrity of the RNA structure after transcription. With the development of CRISPR technology， there are more and more researches on gene editing by Setaria viridis. At present， there is no cloning and functional identification of U6 promoter of S. viridis. The U6 promoter is species-specific. In transgenic technology， using the U6 promoter of the transformed species itself or relative species can achieve higher activation efficiency. In this study， two U6 promoter genes of S. viridis were cloned， and U6 promoter sequences with different length were constructed to drive GUS gene expression. GUS fusion expression vector was transformed into embryogenic callus of S. viridis， and the transient expression verification showed that the two cloned U6 promoters of S. viridis had strong activation efficiency on S. viridis. After the vector was transformed into S. viridis， the transgenic plants were obtained which could stably expressing GUS gene. The U6 promoter was used to construct CRISPR editing vector of PDS gene of S. viridis， and the albino seedlings with stably expressing GUS gene were obtained， which indicated that the cloned U6 promoter of S. viridis could well start the tran-scription of gene editing vector.

Keywords： Setaria viridis; U6 promoter; CRISPR system; RNA interference

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.0014

由于許多粮食作物为禾本科、单子叶植物，而传统的模式植物拟南芥则为双子叶植物，与单子叶植物亲缘关系较远，在双子叶模式植物中研究单子叶植物的基因功能时有时会出现同家族基因功能的严重分化，甚至基因功能完全相反。因此，在拟南芥中对单子叶植物基因功能的研究，离最终农作物中的应用还很远。而单子叶的狗尾草（Setaria viridis）具有双子叶模式植物拟南芥作为模式植物的优点，比如生长周期短、植株矮小、易于种植、容易转化、基因组小、二倍体、能产生大量自交系种子等;因此狗尾草是优良的研究单子叶植物的模型;此外狗尾草是C4植物，而拟南芥是C3植物，因此狗尾草还是研究C4植物的模式植物;它起源于热带，与谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草类亲缘关系接近，更是谷子（Setaria italica）的野缘近亲种，亦是研究人工选择对作物进化影响的模式植物;狗尾草对非生物胁迫耐受能力强，抗性基因丰富，是研究耐旱、耐热、耐盐等胁迫反应的重要模式;狗尾草与重要的能源作物柳枝稷、芒草等黍亚科草类形态学上非常相似，因此狗尾草还是研究这些能源草类的重要模式植物[1-10]。

U6启动子是二型启动子，与真核生物RNA聚合酶III结合后，负责转录U6 RNA，这类启动子的特点是几乎所有启动子元件（除了+1位的转录起点）都位于转录起始位点的上游，也即它对转录起点后的序列无特殊选择或要求，能保证转录序列的结构特征。U6启动子+1位是鸟苷酸。RNA聚合酶III启动子识别的终止信号是连续4～5个胸苷酸，转录产物末端一般有4个尿苷酸。几乎所有的真核生物都具有U6启动子，U6启动子在真核生物体内一般是启动小片段的表达，不带PolyA尾的序列，由RNA聚合酶III聚合U6启动子转录产生shRNA，经剪切后产生成熟siRNA，产生干扰效果;shRNA的表达量取决于启动子的强弱，与同类的RNA聚合酶III的启动子H1相比，U6启动子启动能力更强，表达时间也长。

在转基因技术领域，U6启动子多用在构建RNAi表达载体上，用于启动干扰发夹结构的表达;此外，随着基因编辑技术的兴起，U6启动子也被开始广泛用于CRISPR系统中引导序列复合RNA结构（CrRNA+sgRNA）转录的启动表达，以保证引导序列的结构特征。U6启动子具有种属特异性，在转基因技术中，使用转化物种本身或接近物种的U6启动子能取得更高的启动效率。有研究表明，U6启动子有几个明显的特点[11]：（1）具有TATA box，位于–30～25 bp，被Pol Ⅲ转录;（2）在转录起点上游–66～47 bp处存在PSE （proximal sequence element），该元件是snRNA激活因子蛋白复合物的结合位点;（3）在–244～214 bp处存在DSE（distal sequence element）;（4）启动子下游存在5-TTTT-3序列为Pol III提供转录终止信号;（5）PSE和DSE之间的距离变化可显著影响转录效率;（6）+1位的G对转录效率影响较大。根据这些特点，在使用U6启动子构建表达载体时，U6启动子的长度最好在300 bp左右，尽量不改变PSE和DSE的间距，同时保留TATA box和+1位的G，在下游应有5-TTTTT-3序列作为终止信号。另外可以根据需要在启动子上游或终止信号下游设计测序引物序列、酶切位点等等。

通常首选PDS基因作为开展植物基因组编辑体系建立时的靶标基因。原因在于：1）PDS基因是类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶，其可催化无色的八氢番茄红素转变为有色的类胡萝卜素[12]，即如果PDS基因突变后，纯合体表型就会变为肉眼可见的白色，方便开展后续研究;2）PDS基因在植物基因组中以单拷贝形式存在[13]，方便设计sgRNA（small guide RNA）的靶位点，可以节省人力物力。

正因为狗尾草作为模式植物的重要性，因此本研究克隆了狗尾草2个U6启动子基因，并构建不同序列长度的U6启动子序列驱动GUS基因的表达，验证U6启动子在狗尾草体内能否正常启动GUS基因的表达，同时，将克隆的启动子用于构建狗尾草PDS基因CRISPR编辑载体，验证它们在启动基因编辑载体转录上的能力。为后续在狗尾草中通过基因編辑来验证基因功能时奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

以狗尾草A10品系为实验材料，材料由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell实验室提供。

1.2  方法

1.2.1  U6启动子的克隆  在https：//phytozome.jgi. doe.gov网站上，用拟南芥AtU6启动子的snRNA序列（gtcccttcggggacatccgataaaattggaacgatacagagaa gattagcatggcccctgcgcaaggatgacacgcataaatcgagaaatgg tccaaatttt）与狗尾草的基因组（Setaria viridis v1.1）序列进行比对（BLAST）。检查比对结果，从中挑选出序列同源性大于95%的位置，下载这些位置的序列信息，并在http：//seqtool.sdsc.edu/CGI/ BW.cgi#！网站上对挑选出的序列进行BOXSHADE（盒式）序列分析比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置。

在下载的U6启动序列USE和TATA框位置前寻找和设计引物，引物设计参考http：// bioin-fo.ut.ee/primer3-0.4.0/网站，尽量选择能区别克隆目标启动序列的引物，引物见表1。然后以狗尾草A10品系的DNA为模版进行PCR扩增，然后对扩增到的片段进行测序比对。PCR试剂购于北京博迈德生物技术有限公司，反应条件为：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，退火设计50～55 ℃和55～60 ℃两个温度梯度45 s，72 ℃ 1 min，32个循环;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。

1.2.2  融合植物表达载体的构建  以带GUS基因的pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）质粒（图1）为骨架质粒，质粒由美国Donald Danforth Plant Science Center的Thomas P. Brutnell实验室提供;以表1克隆的ETARIA 02_Reverse（Q）和SETARIA 04-Reverse U6（S）启动子序列为模版，设计带骨架质粒GUS基因启动子粘性末端的引物（表1）PCR克隆目标启动子序列，通过酶切连接将质粒GUS基因前的ZmUbi启动子替换为克隆的狗尾草U6启动子，构建狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。融合植物表达载体通过DNA测序检测目标启动序列构建情况。用限制性内切酶SpeI和HindIII双酶切骨架质粒，切胶回收后，用T4连接酶连接双酶切质粒骨架和PCR产物，连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒经PCR检测和双酶切反应，两种验证方法都获得与目的基因片段大小一致的条带。表明已成功构建狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。

1.2.3  狗尾草U6启动子的启动能力验证  将对照质粒pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH），狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体pSeU6Q- GUS（SeU6Q-HPH），pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH），转化到农杆菌AGL1菌株，以狗尾草成熟种子诱导的胚性愈伤为转化外植体材料，进行农杆菌转化，共培养5 d后取出胚性愈伤进行GUS染色观察，从GUS基因的GUS染色表达情况评估克隆的U6启动子的启动能力和表达活性。同时，取同等重量的每种愈伤GUS染液的蓝色上清液在620 nm波长（蓝色上清液的最大吸收波长）处测定光吸收值。数据、图标处理在Excel 2010下进行，通过Sigma Plot 10.0软件对数据进行统计分析、差异显著性检验和相关性分析。

將对照质粒pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH），狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH），pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH），农杆菌转化到狗尾草ME34品系，观察转基因植株的GUS基因稳定表达情况。

1.2.4  狗尾草U6启动子和PDS编辑载体构建及转化狗尾草  （1）基因编辑载体改造。以pJG310-GG2质粒为骨架质粒（图2），质粒由美国明尼苏达大学的Daniel Voytas实验室提供，以克隆的Q和S启动子序列为模版，设计带AarⅠ酶切位点的引物对，PCR克隆目标启动子序列，通过酶切连接将pJG310-GG2质粒的TaU6启动子替换为克隆的狗尾草U6启动子，命名为pJG310- Q和pJG310-S。

（2）靶位点的选择。在https：//phytozome.jgi. doe.gov网站上，用拟南芥PDS基因序列（AF360196）与狗尾草的基因组（Setaria viridis v1.1）序列进行比对（BLAST），找到狗尾草PDS基因序列。根据CRISPR/Cas9系统识别PAM序上游约20 nt核苷酸序列的特点，在ORF区域设计带有限制性酶切位点的靶位点（SvPDScutF：5-TAG TGG TGC TTT CTA GCG GAG GTC TG-3;SvPDScutR：5-AAA ACA GAC CTC CGC TAG AAA GCA CC-3）。

（3）PDS CRISPR编辑表达载体构建及转化狗尾草。将SvPDScutF/R稀释成100 μmol/L浓度后各取5 μL，混合均匀到PCR管中，放入PCR仪并按下列程序运行：95 ℃ 2 min，75 ℃ 2 min，37 ℃ 2 min，25 ℃ 2 min，16 ℃保存。取2 μL产物加198 μL ddH2O即为SvPDS双链片段。利用GoldenGate克隆技术将SvPDS双链片段克隆到pJG310-Q载体上，反应体系为：pJG310-Q 150 ng、SvPDS双链片段2 μL、BsaI 1.5 μL、T4 ligase 1 μL、10×T4 DNA ligase buffer 2 μL，ddH2O补足到20 μL。反应程序为：37 ℃ 10 min，16 ℃ 15 min，循环数为10，37 ℃ 15 min，80 ℃ 5 min，16 ℃保存。测序结果显示序列正确。同样的方法将SvPDS双链片段克隆到pJG310-S载体上，并进行终载体的连接。将测序正确质粒命名为pTC278- Q-PDS和pTC278-S-PDS并导入农杆菌感受态AGL1。参考赵辉等[14]的方法，将带pTC278-Q- PDS和pTC278-S-PDS质粒的农杆菌AGL1转化狗尾草ME34品系，观察PDS基因的编辑情况。

2  结果与分析

2.1  狗尾草U6启动子与AtU6启动子snRNA序列比对情况

经过https：//phytozome.jgi.doe.gov网站BLAST比对，与AtU6启动子snRNA序列同源性大于95%的狗尾草基因组位置分别位于如下位置：Chr_08（1个匹配位置），Chr_06（1个匹配位置），Chr_04（1个匹配位置），Chr_02（2个匹配位置），Chr_09（1个匹配位置）。这6个高度同源的snRNA位置，其前方DNA序列，很可能是狗尾草U6启动子的所在位置，下载这6个位置前400～700 bp DNA序列，用http：//seqtool.sdsc. edu/CGI/BW.cgi#！网站进行BOXSHADE比对，找到这些启动序列的USE位置和TATA框位置。比对结果见图3，高度保守的部位为U6基因的snRNA位置，snRNA位置前端是U6基因的启动子位置，标红色下划线的保守部位为U6启动子TATA框位置，拟南芥TATA框位置序列为GTTTATA，狗尾草的TATA框位置序列为（G/A） （C/G）TTATA;标蓝色下划线的保守部位为U6启动子USE位置，拟南芥USE位置序列为GTCCC ACATCG，狗尾草USE位置序列为GT（C/A）CC （A/G）（C/T）（A/C）（T/C）CG。比对结果的保守序列位置表明，这6个狗尾草U6启动子可能具有启动转录的功能。

2.2  狗尾草U6启动子的克隆及融合表达载体的构建

经梯度PCR实验鉴定，U6启动子Q基因片段最佳退火温度为60 ℃，S基因片段最佳退火温度为55 ℃。回收Q引物对在60 ℃退火条件下的反应产物（图4），回收S引物对在55℃退火条件下的反应产物（图4），测序结果表明（图5），PCR克隆的目标序列跟预期序列一致。将之前克隆的S（U6）启动子和Q（U6）启动子，通过酶

切连接将质粒GUS基因前的ZmUbi启动子替换为克隆的狗尾草U6启动子S和Q，构建狗尾草U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。测序验证结果表明成功构建了U6启动子与GUS基因融合植物表达载体。

2.3  GUS融合表达载体转化狗尾草胚性愈伤瞬时表达情况

观察GUS融合表达载体转化狗尾草愈伤后的染色情况，收集胚性愈伤观察拍照（图6）。同时，取同等重量的每种愈伤GUS染液的蓝色上清液在620 nm波长（蓝色上清液的最大吸收波长）处测定光吸收值（表2），差异显著性检验和相关性分析表明，以农杆菌AGL 1进行愈伤瞬时表达转化，目标载体启动子Q、S与对照Ubi启动子启动能力差异不显著（表2）。这表明经改造后的2个U6启动子都可以高效的启动GUS基因的表达。

2.4  GUS融合表达载体转化狗尾草后的表达情况

将具有瞬时高表达能力的GUS融合表达载体pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH）、pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH）載体转化狗尾草，获得稳定表达转基因植株，从转基因植株叶片GUS染色可观察到，克隆的狗尾草U6启动子能够启动组成型GUS基因的稳定表达，但稳定表达量不如Ubi组成型启动子的表达效率高（图7）。

Ubi是对照载体pZmUbi-GUS（ZmUbis-HPH）载体，S是pSeU6S-GUS（SeU6S-HPH）载体，Q是pSeU6Q-GUS（SeU6Q-HPH）载体，CK是不经转化的愈伤，为空白对照。

NoteUbi is the control vector pzmubi pZmUbi-GUS （ZmU-bis-HPH）， S is the vector pSeU6S-GUS （SeU6S-HPH）， Q is the vector pSeU6Q-GUS （SeU6Q-HPH）， CK is the callus without transformation， which is the blank control.

2.5  PDS CRISPR编辑表达载体转化狗尾草验证

将带pTC278-Q-PDS和pTC278-S-PDS质粒的PDS基因编辑载体以及含有小麦TaU6启动子的对照载体转化入狗尾草ME34品系，从PCR鉴定阳性的转化苗的再生情况可明显的观察到部分转化植株得到了编辑，编辑后的狗尾草苗表现出白化现象（图8）。这表明PDS基因被编辑后突变了，才会出现白化苗，同时也证明了经改造后的U6启动子可以很好的启动编辑载体的表达。

3  讨论

U6启动子是二型启动子，在生物体内与真核生物RNA聚合酶III结合负责转录U6RNA。随着转基因技术和基因编辑技术的发展，由于U6启动子转录活性较高和从G碱基开始转录的特性，有明确的转录起始位点，能消除无关DNA序列的转录，大大减少脱靶效应[15-17]。U6启动子被使用得越来越多，主要利用于启动RNAi表达载体的RNA发夹结构的转录和CRISPR系统引导序列复合RNA结构（CrRNA+sgRNA）的转录。Sun等[18]克隆了大豆11个U6启动子，并将其中的GmU6启动子用于启动sgRNA转化大豆，结果表明与拟南芥AtU6启动子的启动效率相比，GmU6启动子诱导的大豆基因编辑效率远远高于拟南芥的AtU6启动子，从3.2%～9.7%提高到14.7%～20.2%。还有研究者为了比较拟南芥和苹果U6启动子在苹果中的转录活性，将AtU6-1P：： LUC和MdU6-10-3P：：LUC载体分别瞬时转化至苹果愈伤组织，结果表明MdU6-10-3P：：LUC转染的愈伤组织荧光信号强度显著高于AtU6-1P：：LUC。说明在苹果愈伤组织中，苹果U6启动子的转录活性高于拟南芥U6启动子[19]，以上结果都表明使用受体材料本身的U6启动子会取得更高的基因编辑效率，在亲缘关系较远的物种中转录活性会存在一定差异。U6启动子虽然有较高的启动效率，但在不同物种中启动效率有差异，并且同一物种有多个U6启动子，这些启动子的转录效率也不同[20-21]。

虽然多种植物的U6启动子在CRISPR/Cas9基因编辑体系中得到应用，但U6启动子在亲缘关系较远的物种中并不适用[22]。目前，还没有狗尾草内源U6启动子介导的CRISPR/Cas9基因编辑体系。本研究克隆了2个狗尾草U6启动子Q和S，并进行了功能验证，实验结果显示克隆的Q（414 bp）和S（204 bp）启动子都能很好的启动RNA结构的转录，之所以克隆一个序列比较短的S启动子，是因为前人研究表明，U6启动子在具备必要元件时即具有转录活性，反而序列过长可能存在一些抑制因子，使较长的U6启动子的转录活性下降[19，23]。番茄上的U6启动子被截取到200 bp左右时仍具有较高的活性[24]，棉花上的U6启动子截取到105 bp仍具有较高的活性[25]。实验证明序列比较短的U6（S）启动子甚至能启动组成型基因GUS在狗尾草上的表达，启动GUS基因的瞬时表达量与组成型玉米Ubi启动子启动效率差异不显著，但在转基因狗尾草上的稳定表达量比组成型玉米Ubi启动子低。这主要是因为U6启动子的功能主要是高效启动编辑载体的表达，在启动过表达基因的表达方面没有组成型启动子的启动能力更强。但该实验证明了我们克隆的U6启动子可以正常启动GUS基因的表达。

狗尾草U6启动子Q和S编辑载体转化狗尾草的实验结果证明了利用克隆的狗尾草U6启动子可以启动CRISPR编辑载体的表达，狗尾草PDS基因被成功编辑，转基因狗尾草出现了白化苗，这表明克隆的2个狗尾草U6启动子都能很好的启动编辑载体的表达，在狗尾草上都有较强的转录能力，能很好地作为狗尾草及近亲转基因技术和基因编辑技术的重要启动子工具。

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责任编辑：沈德发