北京地区梨树主要病毒和类病毒检测

2021-12-23黄闻霆王胜男李天忠程玉琴

中国农业大学学报 2021年11期

曾棋黄闻霆池海王胜男姜峰李天忠程玉琴

(中国农业大学园艺学院，北京 100193)

病毒病是影响梨果产量和品质的重要因素之一。据报道，有21种病毒可侵染梨树[1]。最近在我国又发现了1种侵染梨树的新病毒，暂命名为梨褪绿叶斑伴随病毒(pear chlorotic leaf spot-associated virus)[2]。研究表明苹果茎沟病毒(apple stem grooving virus, ASGV)、苹果茎痘病毒(apple stem pitting virus, ASPV)和苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV)是梨树上发生最普遍的3种重要病毒[3]。此外，苹果锈果类病毒(apple scar skin viroid，ASSVd)在世界各地梨栽培地区也普遍发生，严重影响梨果产量和品质[4]。

病毒和类病毒在梨树上通常为复合侵染[5]，带毒无性繁殖材料和带毒嫁接是其传播的主要途径。因此摸清现有梨树上主要病毒和类病毒的发生情况对于防控梨病毒病害具有十分重要的意义。

我国梨栽培面积和产量均为世界第一，其中河北、安徽、河南、新疆、辽宁、陕西和山东等主产区的种植面积占我国梨种植总面积的一半左右，产量约为我国梨总产量的64%[6]。梨也是北京地区出产的第二大水果。据统计，2017年北京梨栽培面积为6 700 hm2，产量达9.07万t[6]，梨产业已成为带动北京农业经济发展的支柱产业之一。但是目前对于该地区梨树感染病毒和类病毒的情况尚不清楚。由于ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd在世界各地梨树栽培地区发生普遍，因此，本研究利用RT-PCR方法对采自北京市重要梨果生产区县的157份梨树样品进行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd检测，旨在评估北京地区梨树的健康状况并明确感染病毒和类病毒的主要种类，以期为管理和规范梨苗木生产和健全苗木检疫制度提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

阳性对照为已知感染ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd的‘冬蜜’和‘砀山酥梨’，栽种在中国农业大学上庄试验基地。阴性对照为本课题组保存的‘红宝石’和杜梨脱毒组培苗。

DNA分子量标准购自中科瑞泰生物科技有限公司；反转录试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；RNA提取试剂盒(EASY spin plant RNA extracting kit)购自北京博迈德基因工程技术有限公司；琼脂糖购自Sigma公司；PCR预混液(2×TaqMasterMix)购自康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1样品采集

2019年和2020年的10月下旬在北京市门头沟、大兴和海淀区的10个梨园中采集了157份样品，包括‘京白梨’、‘鸭梨’、‘园黄梨’、‘丰水梨’、‘玉露香’、‘黄冠’和‘翠冠’等51个栽培品种。门头沟区的东山和王平等4个果园的梨品种均为‘京白梨’，树龄大多为15年左右，每个果园随机选择12～15 棵树采集样品，其中在东山果园还另采集2株百年树龄样品。大兴和海淀区6个梨园的梨树树龄为1～20年，在每个果园对每个梨品种随机选取1棵梨树进行样品采集。

从每棵梨树上采集一年生枝条2份，随后在室内分别剥取样品的韧皮部组织并保存在-80 ℃冰箱中待用。

在所有调查的果园中，梨树均为嫁接苗，砧木是杜梨。本研究进行调查和采样的时间为10月底，绝大多数果园的梨树叶子已开始变黄，有些果园的梨树甚至开始落叶，同时由于病毒在梨树上通常为潜隐性侵染，因此在采样时未能观察到梨树上有明显病毒病症状。

1.2.2检测引物

根据NCBI上ACLSV复制酶(Putative viral replicase)基因序列信息，自行设计检测引物。ASGV、ASPV和ASSVd的检测引物均参考已发表文献[7-9]。引物由生工生物工程有限公司合成。引物名称、序列、退火温度和扩增片段大小如表1所示。

1.2.3总RNA提取

将一年生梨枝条韧皮部组织(100 mg)加液氮研磨成粉末。将粉末转移到2 mL的离心管中，然后按照RNA提取试剂盒的操作手册提取总RNA。

1.2.4RT-PCR

在0.2 mL的PCR管中加入8 μL总RNA、8 μL RNase free H2O和4 μL 5×TRUE RT MasterMix(试剂盒自带)，用移液枪吸打混匀。25 ℃ 孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s。

反转录后随即进行PCR扩增。25 μL的扩增体系中包括2 μL cDNA、2. 5 μL 10×buffer缓冲液、2 μL dNTP、各0. 5 μL的正向和反向引物(20 μmol/L)、0. 2 μL DNA聚合酶(5 U/μL)及17. 3 μL ddH2O。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，54～60 ℃退火30 s (退火温度详见表1)；72 ℃延伸24～45 s(根据产物长度确定)，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时选取部分样品的PCR产物送去测序以验证检测结果。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 结果与分析

2.1 RT-PCR检测ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd

利用RT-PCR方法检测阳性对照梨树样品(‘冬蜜’和‘砀山酥梨’)中的病毒和类病毒，阴性对照为‘红宝石’和杜梨脱毒组培苗。由图1可知，在2个阳性样品‘冬蜜’和‘砀山酥梨’中均扩增到ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的特异性条带，而在阴性对照‘红宝石’和杜梨脱毒组培苗中则未出现特异性扩增条带。为了进一步确定检测结果，将阳性样品的PCR产物送公司测序。将测序结果在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行比对分析，结果显示这些扩增产物分别为病毒和类病毒对应的基因片段。上述结果表明，本研究所采用的RT-PCR方法可特异性地检测梨树样品中的ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd。

M， DNA分子量标准(100～2 000 bp)；泳道1～4，分别为ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的检测结果。M, DNA molecular weight marker (100-2 000 bp). Lanes 1-4, PCR products for detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively.图1 RT-PCR检测梨树样品ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVdFig.1 Detection of ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd in pear samples by RT-PCR

2.2 北京地区梨树样品病毒和类病毒的检测结果分析

利用RT-PCR对北京地区采集的所有梨树样品进行ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd检测。其中在检测采自门头沟区4个果园的51份‘京白梨’样品时发现，同一果园的不同‘京白梨’植株，其感染病毒的种类也不尽相同。以采自门头沟区东山果园的样品为例，对9个‘京白梨’样品进行RT-PCR检测(图2)，其中泳道1和3分别是采自2株百年树龄‘京白梨’的样品，泳道2、泳道4～9分别为采自不同株15年树龄梨树的样品。图2(a)显示了从各样品所提取的总RNA，其28S和18S条带清晰，且前者宽度约为后者的两倍；图2(b)显示了在各样品中均扩增到内参基因actin的特异性条带，这些结果再次表明RT-PCR检测体系的可靠性。由图2(c)～(f)可知，9个‘京白梨’样品所感染的病毒种类并不相同。其中2株百年树龄老树(泳道1和3)和1株15树龄梨树(泳道7)均感染了ASGV、ASPV、ACLSV 和ASSVd。在其它6株15年树龄的‘京白梨’中， 1株(泳道8)感染了ASGV，3株(泳道5、6和9)感染了ASGV+ACLSV，1株(泳道2)感染了ASGV+ASSVd，1株(泳道4)则感染ASGV+ACLSV+ASSVd。采自门头沟区其它3个果园的‘京白梨’样品也显示出相似的检测结果(表2)。

(a)总RNA电泳图;(b)～(f)分别为扩增内参基因actin、ASGV、ASPV、ACLSV和ASSVd的PCR产物电泳结果；M,DNA分子量标准；P,阳性样品(‘冬蜜’)；N,阴性对照(‘红宝石’脱毒组培苗)；泳道1～9，分别为采自门头沟区东山果园的9个‘京白梨’样品。(a) Total RNA; (b)-(f) PCR products for detection of actin (the internal reference gene), ASGV, ASPV, ACLSV and ASSVd, respectively. M, DNA molecular weight marker. P, positive control sample (‘Dongmi’). N, negative control sample (virus-free pear ‘Hongbaoshi’ plantlets). Lanes 1-9, nine ‘Jingbaili’ samples collected from Dongshan orchard in Mentougou district.图2 RT-PCR检测部分‘京白梨’样品病毒和类病毒Fig.2 RT-PCR detection of viruses and viroids in several pear (‘jingbaili’) samples

表2 门头沟不同果园‘京白梨’样品中病毒和类病毒的发生情况分析Table 2 Occurrence of viruses and viroids in pear (‘Jingbaili’) samples collected from different orchards

对大兴、海淀及门头沟区果园中的‘翠冠’,‘黄冠’,‘玉露香’和‘京白梨’等51个品种总计157份梨树样品的检测结果进行分析(表3)，北京地区梨树上普遍感染了ASGV，检出率高达91.1%。其中采自门头沟区的51个‘京白梨’样品均检出ASGV，检出率为100%；采自大兴区的45个样品和海淀区的61个样品中，该病毒的检出率分别为97.8%和78.7%。

北京地区梨树ASPV和ASSVd的检出率分别为59.2%和54.8%，其中采自海淀区的样品中ASPV和ASSVd的检出率相对较高，分别为73.8%和65.6%，而在大兴和门头沟区的梨树样品中ASPV和ASSVd的检出率相对较低。梨树样品中ACLSV的检出率较低，为35.7%，但该病毒的检出率在不同采样地点间的差异较大。其中在门头沟区‘京白梨’样品中，该病毒的检出率高达92.2%，而在大兴和海淀区样品中的检出率仅为8.8%和8.2%。上述结果表明，ASGV是侵染北京地区梨树的最主要病毒种类，其次为ASPV和ASSVd，ACLSV的发生率相对较低，但在门头沟区‘京白梨’品种上发生普遍。

本研究在所调查的大多数果园中，对每一梨品种进行随机抽样检测，由于同一果园相同品种的不同植株之间可能携带不同的病毒种类(图2和表2)，因此对本次调查的大多数梨品种而言，分析这些品种间带毒率的差异可能没有太大的参考价值。但少数几个梨主栽品种如‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黄冠’等所检测的样品数相对较多，故对这4个品种病毒和类病毒的发生情况进行了统计分析，结果见表4。由表可知，ASGV和ASPV是侵染‘翠冠’和‘玉露香’的主要病毒种类，而ACLSV和ASSVd没有或极少检出。‘黄冠’品种上病毒和类病毒的发生情况与‘翠冠’和‘玉露香’类似，只是ASSVd的检出率相对较高。‘京白梨’则普遍感染了ASGV和ACLSV，同时ASPV和ASSVd的检出率也分别达到43.1%和49.0%。这些结果表明，不同梨品种所感染的病毒种类存在明显差异，且‘京白梨’感染病毒和类病毒的情况更为严重。

表3 北京地区梨树病毒和类病毒发生情况分析Table 3 Occurrence of viruses and viroids in pear plants in Beijing

表4 4个梨主栽品种病毒和类病毒发生情况统计Table 4 Occurrence of viruses and viroids in four popular pear cultivars

2.3 北京地区梨树上病毒和类病毒复合侵染情况

对北京地区梨树样品中病毒和类病毒复合侵染情况进行统计，结果见表5。在所检测的157份样品中，有24份样品只检出1种病毒或类病毒。其中18份样品只检出ASGV，4份样品只检测出ASPV，其他2份样品分别只检测出ACLSV和ASSVd。其余133份样品则为多种病毒(包括类病毒)的复合侵染，占样品总数的84.7%。其中受到ASGV+ASPV+ASSVd复合侵染的样品数量最多，占所检样品数的25.5%；受到ASGV+ASPV或ASGV+ACLSV侵染的各有11.5%的样品；各有10.2%的样品分别感染了ASGV+ASPV+ACLSV+ASSVd或ASGV+ASSVd。此外，有5.8%、5.1%、2.5%和2.5%的样品分别受ASGV+ACLSV+ASSVd、ASGV+ASPV+ACLSV、ASPV+ASSVd和ASPV+ACLSV的复合侵染。以上说明北京地区梨树受到病毒复合侵染的现象远比单一侵染的更普遍，该结果为北京地区梨病毒病防控提供了参考。

表5 北京地区梨树病毒(类病毒)单一侵染和复合侵染情况Table 5 Occurrence of single and mixed infection in pear plants in Beijing

3 讨论

ASGV、ASPV和ACLSV是侵染梨树的3种主要病毒种类，但这几种病毒在不同国家或地区梨园中的发生率有明显区别。如在主栽东方梨品种的韩国，ASGV是侵染该国梨树的最主要病毒种类，检出率为74.2%，其次为ASPV(34.8%)，而ACLSV则极少检测到[10]；在拉脱维亚[11]和突尼斯[12]等主栽西洋梨品种的国家，ACLSV是最主要的病毒种类；在我国，杨蕊等[13]用RT-PCR检测了天津地区的梨树样品，结果表明ACLSV(47.1%)的检出率最高，其次为ASPV(11.4%)和ASSVd (10%)，而ASGV的检出率只有8.6%。本研究结果显示，ASGV是侵染北京地区梨树的最主要病毒种类，检出率高达91.1%，其次为ASPV(59.2%)，ACLSV的检出率(35.7%)相对较低。本研究检测的梨树样品数为157份，涉及‘京白梨’、‘鸭梨’、‘园黄梨’、‘丰水梨’、‘玉露香’、‘黄冠’和 ‘翠冠’等51个栽培品种，而杨蕊等[14]检测的梨树样品为70份，只涉及7个品种，样本数量可能是导致调查结果出现差异的原因。这表明了今后需开展全国范围内的广泛和系统的调查，以摸清我国梨树病毒和类病毒的发生情况。

北京地区梨树样品中ASSVd的检出率高达54.8%，该数值明显高于韩国[10]、波黑[14]和希腊[15]等国报道的数据。虽然目前尚未系统研究ASSVd对梨品种果实的危害，但是已有研究表明ASSVd可导致梨品种‘Niitaka’的果实出现明显的凹果(Dimpling)病症, 严重影响梨果品质[16]。因此鉴于ASSVd对梨果实的潜在危害，在北京地区进行梨树苗木繁育和调运过程中，相关部门需加强对ASSVd的检测。

本研究发现所有检测的样品均受到病毒侵染，而且有84.7%的梨树样品受到多种病毒(包括类病毒)的复合侵染，该数值显著高于世界上其他国家如拉脱维亚[11]和突尼斯[12]等国家报道的数据。在以后的工作中，需要进行更多梨树品种和数量的病毒携带情况调查，从而为苗木生产和繁育提供数据支持和指导。

本研究结果表明‘京白梨’、‘翠冠’、‘玉露香’和‘黄冠’等不同梨品种所携带的病毒种类各不相同，这与Pūpola等[11]报道一致。需要引起重视的是，本研究通过对门头沟区4个果园单一栽培品种(‘京白梨’)的广泛调查发现，即使是同一果园同一品种的不同梨树，所感染的病毒种类也存在着明显差异。由于无法得知这些果园接穗和砧木的来源及其当时带毒情况，目前尚不清楚造成这种结果的确切原因。有报道表明，苹果和梨种子也是传播病毒(类病毒)的途径之一[17-20]，因此推测砧木(杜梨实生苗)带毒可能是同一果园内的不同‘京白梨’树感染不同病毒种类的原因；另一个原因可能是‘京白梨’接穗来源不同而携带不同病毒种类所致。在以后的研究中，需要对更多果园中其它梨品种的不同植株进行病毒和类病毒检测，以分析这种现象是否具有普遍性。