miR-221和TIMP2在早发型重度子痫前期合并胎儿生长受限患者血清和胎盘中的表达

陈 嵘 林小红 黎 云 周宇恒

广东省妇幼保健院(广州,511400)

子痫前期合并胎儿生长受限(FGR)是导致不良妊娠结局的重要风险因素，其中早发型重度子痫前期(EOSP)合并FGR的发生率为10%～70%，严重影响胎儿后期生长发育[1-2]。引起FGR的因素有多种，胎盘发育和功能障碍是其中因素之一。研究表明，微小RNA(miRNA)在妊娠期高血压、子痫前期等疾病中异常表达，与患者预后相关[3]。miR-221是miRNA之一，miR-221可通过下调凋亡抑制蛋白bcl-2的表达促进人滋养细胞凋亡，导致胎盘功能障碍，损害胎盘正常功能[4]。基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)是对基质金属蛋白酶2(MMP-2)具有抑制作用的糖蛋白，研究表明，TIMP-2在子痫前期患者胎盘滋养细胞中表达升高，与MMP-2在滋养细胞浸润过程中相互影响，参与子痫前期发病[5]。目前miR-221和TIMP-2在EOSP合并FGR研究报道不多。本研究探讨miR-221和TIMP-2在EOSP患者血清与胎盘中表达及其相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2018年9月-2020年10月在本院就诊的EOSP患者256例为观察对象，根据FGR分为非FGR组139例和FGR组117例。FGR诊断：出生体重低于同胎龄总体人群出生体重的10百分位或低于同胎龄正常体重的2个标准差。纳入标准：①符合EOSP诊断标准[6]；②自然妊娠且单胎；③剖宫产终止妊娠。排除标准：①伴有原发性高血压、糖尿病、心血管疾病、甲状腺等疾病；②自身免疫性疾病；③临床资料不全。本研究样本采集均经过本院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

TIMP-2酶联免疫吸附测定试剂盒购自美国Elabscience公司，小鼠抗人TIMP-2单克隆抗体购自Abcam公司，miR-221及内参基因U6序列设计引物由上海生物工程公司合成。

1.3 样品采集及保存

血清样品：抽取孕妇产前空腹静脉血离心取血清，置-80℃保存备用。胎盘组织：胎盘娩出后，无菌剪取胎盘中央靠近脐带部位组织两块，其中一块生理盐水冲洗后置-80℃保存备用，另一块用4%多聚甲醛固定，用于免疫组化。

1.4 血清TIMP-2水平检测

使用酶联免疫吸附法检测血清TIMP-2水平。

1.5 血清与胎盘组织中miR-221表达

使用TRIzol试剂分别提取血清与胎盘组织中总RNA，使用反转录试剂盒反转录得到cDNA，置-20℃保存备用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-221的表达。miR-221及内参基因U6的引物序列见表1。反应结束后，miR-221表达水平采用2-△△CT分析法计算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 免疫组织化学染色

使用免疫组织化学SP法，将固定好的标本常规石蜡包埋，连续4 μm切片、二甲苯脱蜡，柠檬酸缓冲液抗原修复，再除内源性过氧化物酶活性，使用10%山羊血清封闭，加入鼠抗人TIMP-2单克隆抗体(1:1000)，用已知阳性切片作为阳性对照，不加TIMP-2单克隆抗体的PBS缓冲液作为阴性对照，室温孵育2h，再加入二抗孵育30min，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水封片。

1.7 结果判断

光学显微镜下观察，TIMP-2主要定位于细胞膜或细胞质，随机抽取5个高倍视野，每个视野计算阳性细胞数：<5% 0分，6%～25% 1分，26%～50%2分，51%～75% 3分，>75% 4分；按照细胞染色强度评分：未着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。标本评估均由3名专业人员评定取平均值，将两项评分结果相乘，得分0～1分阴性(-)，2～3分弱阳性(+)，4～6分阳性(++)，>6分强阳性(+++)，≥2分统计为阳性。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 两组一般资料比较

非FGR组与FGR组年龄、发病孕周、终止妊娠孕周及初产妇比例均无差异(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 血清及胎盘miR-221、TIMP-2表达水平

FGR组血清miR-221(1.65±0.23)、TIMP-2(38.52±8.36 ng/ml)高于非FGR组(1.03±0.21、25.34±6.78 ng/ml)(t=22.528、13.927，均P=0.000)，胎盘组织miR-221(2.32±0.21)、TIMP-2蛋白阳性表达率(96例，82.1%)高于非FGR组(1.07±0.19)(74例，53.2%)(t=49.969，χ2=23.643，均P=0.000)。

2.3 血清miR-221、TIMP-2与新生儿体重相关性

血清miR-221、 TIMP-2水平均与新生儿体重呈负相关性(r=-0.541、-0.603,均P<0.05)。

2.4 miR-221、TIMP-2 预测EOSP患者发生FGR价值

预测EOSP患者发生FGR，血清miR-221曲线下面积为0.881，截断值为1.52，敏感度为78.6%，特异性为84.6%；血清TIMP-2曲线下面积为0.862，截断值为35.64ng/ml，敏感度为85.5%，特异度为79.5%；血清miR-221、TIMP-2联合预测EOSP患者发生FGR曲线下面积为0.921，敏感度为88.9%，特异度为84.2%。

3 讨论

子痫前期是一种严重的妊娠并发症，其中EOSP患者发病早且病情严重[7-8]。早期评估及治疗对改善不良妊娠结局有重要意义。

miRNA可调控多种生理病理过程，如细胞的增殖与凋亡、疾病以及肿瘤发生。研究表明miRNA异常表达与子痫前期、FGR等妊娠期并发症发生有关[9-10]。miR-221是人脐静脉内皮细胞中确定的特定miRNA，在子宫内膜蜕膜化过程中可参与间质细胞的分化，进而影响滋养细胞浸润能力[11]。秦薇等[12]研究表明，子痫前期孕妇胎盘中miR-221表达水平高于正常妊娠孕妇，与重度子痫前期的发病有关。Yang等[13]研究表明，miR-221-3p在子痫前期患者胎盘组织中表达下调，通过靶向血小板反应蛋白2(THBS2)促进滋养细胞生长、侵袭和迁移。本研究结果显示，EOSP合并FGR患者血清及胎盘组织中miR-221表达水平升高，提示水平升高可能与子痫前期患者FGR有关。

TIMPs能够特异性抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性，TIMP-2对MMP-2 有较高的选择性抑制作用。正常状态下，TIMP-2和MMP-2相对平衡，维持细胞外基质成分的更新和自稳。若二者平衡被打破，会加速基质降解过程[14]。TIMP-2还可参与调控肿瘤细胞的迁移与侵袭，抑制TIMP-2的表达可抑制细胞的侵袭行为[15]。刘亚敏等[16]研究表明，妊娠滋养细胞疾病患者血清TIMP-2水平升高，参与妊娠滋养细胞疾病的发生及进展。本研究结果显示，与非FGR组比较， FGR组患者血清TIMP-2升高，提示TIMP-2与EOSP合并FGR有关，且胎盘组织中TIMP-2蛋白阳性表达率升高，提示TIMP-2表达水平升高可能与FGR胎盘功能障碍有关。

研究认为，子痫前期的发病与胎盘发育异常、血管内皮细胞功能损伤、免疫功能紊乱、遗传因素、炎症反应等有关。本研究发现，FGR组miR-221、TIMP-2水平升高，可能与滋养层细胞功能下降有关，TIMP-2蛋白表达增高，促使MMP-2表达相对减少导致滋养细胞浸润能力下降。研究表明[17]，miR-221可通过靶向TIMP-2促进人脑胶质瘤细胞侵袭与血管生成，本研究推测miR-221、TIMP-2可能通过调控关系参与滋养细胞增殖与侵袭，导致胎儿生长受限。本文经相关分析显示，miR-221、TIMP-2 表达水平与新生儿体重均呈负相关性，进一步证实miR-221、TIMP-2水平升高与EOSP患者发生FGR有关。进一步分析，血清miR-221、TIMP-2联合预测EOSP发生FGR有一定临床价值，可能成为评估EOSP发生FGR的分子标志物。

综上，EOSP合并FGR患者血清和胎盘中miR-221、TIMP-2高表达，且与胎儿生长受限有关，有望成为评估EOSP发生FGR的分子标志物，但其具体作用机制仍需做进一步研究。