慢加急性肝衰竭预后标志物的研究现状

李 健，杜亚秋，李德钊，季慧范，张成港，刘庆夏，郭晓林

吉林大学第一医院 肝胆胰内科，长春 130021

慢加急性肝衰竭(ACLF)是指在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿，常伴随肝脏和肝外器官衰竭，是常见的重症肝病类型之一。目前，有关的临床报道表明ACLF患者28 d无移植病死率高达50%～90%，预后差[1-3]。病毒性肝病、酒精性肝病或两者共同作用是ACLF的主要病因[4]，因地区差异，病因分布并不完全相同。ACLF的发病机制尚未完全阐明，目前认为全身性炎症反应和细胞因子风暴在ACLF和随后的器官衰竭中起着中心作用[5]。对酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)-ACLF，系统性炎症反应是核心机制，而在HBV-ACLF中，HBV激活引起的免疫-代谢失衡发挥了核心作用[6]。

在ACLF中，过度的免疫反应使肝细胞大量坏死，并逐渐扩散至全身，致肝外脏器受累，这种过度和不可控的炎症反应进一步恶化肝损伤[7]，使得ACLF患者短期病死率高。因此，早期、准确的判断患者病情及预后对于提高ACLF患者的生存率及优化资源配置具有重要意义。随着定量蛋白组学技术的进步，肝病候选生物学标志物，尤其是非侵入性血清标志物亦得到发展[8]。近年来新发现的生物学标志物如炎症相关性、代谢相关性、免疫反应相关性等逐渐进入研究者视野，本文就上述不同类型生物学标志物在ACLF预后中的研究现状进行综述，以期为ACLF预后评估提供参考。

1 炎症相关的标志物

1.1 白细胞介素(IL)

1.1.1 IL-23及其受体(IL-23R) 在所有T淋巴细胞亚群中，辅助性T淋巴细胞(Th)17作为CD4+效应T淋巴细胞，被认为是参与多种急慢性肝病发病机制的主要效应细胞[9]，目前研究已经证明ACLF患者的外周血和肝脏实质中Th17增多，同时IL-23R在ACLF患者的Th17上呈现高表达。HBV感染通过抗原呈递细胞，诱导单核细胞来源的树突状细胞产生大量的IL-23，一方面与Th17上的IL-23R结合，激活转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription-3, STAT3)通路，促使Th17功能激活和成熟[10-12]，另一方面通过IL-23/IL-17轴介导肝损伤[13]。激活的Th17产生大量的细胞因子，导致致病微环境，从而促进炎症加重和疾病进展。故在ACLF患者中，异常增高的IL-23/IL-23R介导的信号转导可诱导、加重炎症，与肝病炎症程度密切相关[14]，可以作为预后判断的潜在标志物。

1.1.2 白细胞介素-22(IL-22) IL-22由免疫细胞产生，但主要靶向上皮细胞，最初IL-22被鉴定为一种肝保护性细胞因子，随后被证明可保护多个器官免受损伤。此外，IL-22还通过刺激上皮细胞产生大量抗菌蛋白来防止细菌感染。肝脏再生的过程由多种细胞因子和生长因子激活的多条信号通路共同调控[15]。在这些通路中，信号转导子和STAT3主要由IL-6和IL-22激活，是促进肝脏再生的有效途径；以IFNγ为主的信号转导因子STAT1是阻断肝脏再生的的有效途径。故STAT1和STAT3激活的平衡在控制肝损伤和肝脏再生中起着关键作用。综上，IL-22对重症肝病的预后有一定提示作用。

1.1.3 白细胞介素-6(IL-6) 全身炎症反应是ACLF的标志[1,16]。IL-6在单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞和内皮细胞中产生，并启动急性期蛋白的产生，同时升高的IL-6被认为是一种明显的促炎细胞因子，能迅速激活宿主防御系统，发挥多种功能[17]。在靶细胞上，IL-6与IL-6受体(IL-6R)结合，IL-6/IL-6R复合物与第二受体蛋白糖蛋白(gp)130结合，启动信号传导，信号通路持续激活可能导致肝损伤。已有研究[18]表明，IL-6的动态变化与疾病相关病死率有关，IL-6动态升高或持续高水平的患者病死率较高，故IL-6水平及持续时间同时对疾病的预后有提示作用。

1.2 B、T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator, BTLA) BTLA是CD28超家族的成员，与细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxie T lylnphoeyte assoeiated antigen-4, CTLA-4)、程序性坏死因子1(programmed death-1,PD-1)共同构成了一组抑制性受体。已有研究[19]表明，BTLA负性调节病毒特异性T淋巴细胞的功能、维持T淋巴细胞免疫耐受。ACLF的特点是易感染和T淋巴细胞免疫障碍。一项在健康人群、慢性乙型肝炎、HBV-ACLF患者中开展的研究[20]发现，HBV-ACLF患者外周血CD4+T淋巴细胞的BTLA表达明显增加，而交联BTLA可进一步抑制CD4+T淋巴细胞的活化、增殖及细胞因子的产生，促进CD4+T淋巴细胞的凋亡，使机体丧失清除病原体的能力，最终导致感染加重，从而影响ACLF的预后。

1.3 程序性死亡因子1(PD-1) PD-1是一种广泛表达于多种类型免疫细胞的细胞表面蛋白[21]，如CD8+T淋巴细胞和CD4+T淋巴细胞，且作为一种抑制性调控因子，与程序性死亡因子配体(programmed death ligand, PD-L)结合后，可以抑制T淋巴细胞增殖、IL-2及IFNγ等细胞因子产生，属于负向调节T淋巴细胞作用的刺激信号[22]。研究表明，PD-1的上调可能有效地减轻CD8+T淋巴细胞的致病性反应和肝损伤[5,23]，即随着ACLF病情加重，外周血CD8+T淋巴细胞上PD-1表达增高，与疾病严重程度呈正相关，故PD-1/PD-L的监测在ACLF疾病发展和转归中具有重要意义[24]。

1.4 损伤相关的分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs) DAMPs是细胞损伤或激活后释放的多种具有免疫调节活性的细胞内分子，可通过模式识别受体诱导自身免疫[25]。主要包括高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1, HMGB1)、细胞核来源的组蛋白、热休克蛋白、尿酸、线粒体转录因子等。其中HMGB1是一种很强的炎性因子，在炎症过程中，HMGB1由坏死或凋亡细胞释放，与其受体结合，诱导氧化应激和炎症因子释放，包括TNFα、IL-1、IL-6、IL-8、MIPs等，导致持续的、放大的全身炎症反应，并发生级联反应，进一步加重肝损伤[26]。HMGB1水平越高，ACLF预后越差，故可作为ACLF的一种预后标志物。

2 代谢相关的标志物

2.1 脂多糖(lipopolysaccharides, LPS) LPS是由脂质和多糖组成的内毒素成分，是一种重要的炎症诱导因子，可通过与炎症相关细胞膜表面的Toll样受体4(TLR4)结合进入细胞内并激活下游信号通路，合成促炎因子，推动炎症反应的进行。细菌易位、LPS和DAMPs已经被证实是肝衰竭发病中的重要因素[20]，肝脏Kupffer细胞在LPS的作用下，分泌功能亢进，生成和释放大量氧自由基和细胞因子等，加重肝损伤，同时研究还表明LPS可引起Kupffer细胞微结构改变及自噬[27]。因此，对于有高内毒素风险的患者来说，监测LPS水平显得较为重要，LPS水平更高可能预示患者预后不佳，而及时有效的控制内毒素会使得患者获得更大的临床效益。

2.2 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate , S1P) S1P是内皮完整性的关键因子，可以调节肝脏再生、血管张力控制和免疫应答等过程[28]。在ACLF中，维护血管屏障的完整性是一个重要的过程，可防止某些并发症的出现，如出血、组织水肿、液体失衡、炎症风暴等[29]。有研究[30]表明慢性重症肝病患者血清S1P水平随肝病进展而进行性下降，可作为早期死亡的预测指标。

2.3 M30/M65 M30/M65是一种反应肝细胞坏死及凋亡的标志物。角蛋白18(cytokeratin18, CK18)是构成肝细胞骨架的主要中间丝蛋白之一，参与肝细胞骨架的构成，对肝细胞周期及凋亡起一定的调控作用。CK18在肝细胞凋亡过程中，被切割成M30抗原片段，故通过血清M30能够反映肝细胞凋亡水平。在坏死过程中，完整的CK18和角蛋白复合体被释放出来，M65能够对其及切割过的CK18片断进行识别，故在此过程中，M65水平随着坏死过程的进行而升高。目前已被用作急慢性肝病诊断和预后的生物标志物，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和急性肝衰竭(ALF)。且已有研究[31]表明，在ACLF患者中M30和M65水平均明显升高，且是3个月短期病死率的独立预测因子。

2.4 甲胎蛋白(AFP) 目前的临床研究很少有通过肝脏再生角度来评价ACLF的预后。AFP是一种体内丰富的血浆蛋白，是一种肝细胞再生的标志物。成人血清AFP高表达通常表明慢性肝炎或肝硬化患者发生肝细胞癌的可能性增高[32]。有研究表明[33]，在除外肝癌、胃癌等恶性肿瘤，AFP水平越高，HBV-ACLF预后越好，log10AFP≥2提示ACLF患者短期生存时间越长，这表明log10AFP是预测ACLF预后的有用指标。AFP可能是预测ACLF患者病死率的另一个重要指标。

2.5 纤溶酶原 纤溶酶原是一种蛋白酶原，主要合成于肝脏，存在于血浆，在激活物作用下变成有活性的纤溶酶，且在肝功能严重受损时会显著降低。有研究[7]发现，入院时低水平的纤溶酶原与ACLF患者的病死率显著相关，且在住院期间，纤溶酶原水平在生存组中逐渐升高，死亡组中逐渐下降。这种变化反映了ACLF患者病情改善、恶化和波动的过程。可能机制是：在ACLF患者中，纤溶酶原活化系统中的尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)和纤溶酶可活化肝细胞生长因子，参与肝损伤后基质重塑、调节肝损伤后肝细胞再生，故低水平的纤溶酶原可以阻碍肝细胞再生[34-35]，由此出现肝损伤、纤溶酶原消耗、肝细胞再生受损的恶性循环。故纤溶酶原可能是HBV-ACLF的一种潜在的预后生物标志物。

3 免疫相关的标志物

3.1 补体3(complement factor 3, C3) 补体是广泛存在于血清、组织液和细胞膜表面的一组经活化后具有酶活性的蛋白质，其中C3水平在补体系统中最高。肝脏是生成免疫因子的重要器官，随着肝功能的恶化，肝脏合成补体的能力逐渐降低。在NAFLD中，补体系统的广泛激活与疾病严重程度的关系已经得到证实[36]，现多研究其在慢性乙型肝炎、ACLF中的作用。在ACLF患者中，研究发现生存组的C3和C3a的水平明显高于死亡组，同时C3和C3a水平与MELD和CLIF-C Ofs评分呈负相关，这提示补体C3和C3a可能是ACLF的独立预测因子[37]。

3.2 可溶性CD163(sCD163)和可溶性甘露糖受体(soluble mannose receptor, sMR) 肝脏Kupffer细胞占机体巨噬细胞总数的80%以上，在病毒性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎的肝脏炎症和纤维化中起着关键作用[38]。CD163作为血红蛋白结合珠蛋白清除剂受体，仅位于巨噬细胞和某种单核细胞上，并在脱落后，作为sCD163释放到循环中。sMR在人血清中被发现，是一种主要在巨噬细胞和树突状细胞上发现的甘露糖受体的脱落产物，尽管对于该标志物研究较少，但在肝病、感染患者的血清中，sMR水平高于健康人群[39-40]。当被细菌和其他促炎细胞因子刺激时，预激活的Kupffer细胞会引发剧烈的炎症反应，使得血清sCD163和sMR水平升高，从而促进ACLF的进展。研究[41]表明，炎症标志物sCD163、sMR与MELD评分、CLIF-C ACLF可作为ACLF患者28、90和180 d病死率的预测因子。这提示肝Kupffer细胞在ACLF发生和发展中的重要性，因此，将巨噬细胞生物标志物，如sCD163、sMR等纳入预后评分(如CLIF-C ACLF和CLIF-C AD)中，可能预测能力更佳。

3.3 中性粒细胞明胶酶相关脂质沉积蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) NGAL是脂质运载蛋白2(lipocalin-2, LCN2)的基因表达产物，广泛表达于各种组织和细胞，尤其是中性粒细胞[42]，作为一种急性期蛋白，可以调节各种免疫反应。当肾小管损伤时，肾脏合成NGAL增加，故尿NGAL水平升高，可作为肾功能不全的预测因子。最近研究[42]发现，在ACLF患者中，LCN2在肝脏总体表达显著上调，并与INR和胆红素相关，这提示肝细胞损伤可能导致NGAL升高。此外，中性粒细胞是表达LCN2的主要细胞类型，参与抗炎过程，也可以导致血浆NAGL增加。由此，ACLF血浆NGAL升高可能归因于严重的肝细胞损伤与中性粒细胞活化[43-44]，进而引发后续的器官功能障碍，影响疾病预后。一项研究[42]结果显示，肝硬化患者的NGAL水平显著增加并与ACLF患者的预后呈现相关性。另外，CANONIC研究数据[45]亦显示NGAL是ACLF病死率的重要预测因子。

4 核酸类标志物

miRNA是一种内源性的非编码微小RNA，其功能是抑制特定的靶信使RNA(messenger RNA, mRNA)，从而调节特定的细胞蛋白质和细胞表型。miRNA通过控制mRNA的稳定性或翻译过程来调节表达，从而影响细胞的分化、发育和凋亡[46]。越来越多证据[47]表明，某些miRNA可能与肝衰竭预后有关。其中miRNA-122是一种肝脏特异性miRNA，约占成人肝脏总miRNA数量的70%。miRNA-122在严重的ACLF和凝血疾病患者中明显上调[48]。另有研究[49]发现miR-146a-5p、miR-122-3p和miR-328-3p等是ACLF短期死亡的独立预测因子。这为进一步研究miRNA在ACLF发病机制及预后中的作用奠定基础。

5 氧化应激标志物

氧化应激反应可以触发体内细胞凋亡，是各种疾病发展过程中的关键步骤。晚期氧化蛋白产物(advanced oxidation protein products, AOPP)是体内氧化应激过程中生成的一类含双酪氨酸的蛋白质交联物。在氧化应激状态下，氧化还原反应失衡导致蛋白质的氧化速率急剧增加，导致体内AOPP水平明显升高，同时AOPP主要经肝脏清除，在肝功能衰竭时，AOPP清除率降低，导致AOPP产生与清除失衡，加重氧化应激过程。同时研究还发现AOPP能够诱导单核细胞分泌TNFα等炎症因子，加重肝细胞的凋亡。血清AOPP反映HBV-ACLF患者的氧化应激、炎症状态[26]，故可作为预测HBV-ACLF患者预后的重要潜在标志物。

6 小结与展望

目前ACLF 缺乏除肝移植以外的有效治疗措施，具有高临床病死率。因此，尽早探寻ACLF早期诊断、预警、预测的分子标志物至关重要。血清生物学标志物具有非侵入性、易于检测、可反映肝损伤程度等特征，有广阔的临床应用前景。尽管本文总结了多种预后相关指标，但可用于临床实际的标志物仍缺乏可靠依据和标准参考值，需要更多的实验数据和大量的临床病例来验证。期待灵敏度更高、特异性更好、便于临床检测的预后标志物出现，以提升ACLF患者的多脏器衰竭的防治水平，有效改善ACLF的转归。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：李健、郭晓林负责拟定写作思路；李健、杜亚秋、李德钊、张成港、刘庆夏负责检索文献，分析资料；季慧范、郭晓林负责修改文章并最终定稿。