非酒精性脂肪性肝病对肠道免疫细胞的影响

雷亚兰，毕 俭，毛靖伟

大连医科大学附属第一医院 消化内科，辽宁 大连 116011

随着肥胖、糖尿病等代谢疾病发病率日渐上升，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为全球公共卫生问题。全球NAFLD平均患病率为25%，NAFLD及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)在美国患病率分别为30%和5%[1]。在我国，NAFLD患病率从2001年23.8%急剧上升到目前32.9%，正取代乙型肝炎成为慢性肝病的主要原因[2]。NAFLD与肠道免疫密切相关[3-4]，肠道免疫失衡促进NAFLD肝脏炎症、纤维化进展，而NAFLD能够引起肠道免疫紊乱[5]。通过肠肝循环以及免疫细胞募集、再循环，NAFLD与肠道免疫相互作用。本文就NAFLD对肠道免疫细胞的影响进行系统性阐述，以期从肠道免疫角度为防治NAFLD寻找新的治疗靶点，进而延缓、甚至阻断疾病进展。

1 NAFLD对肠道免疫细胞的影响

1.1 NAFLD与肠道巨噬细胞 肠道巨噬细胞不仅在固有免疫中起作用，在适应性免疫中也充当抗原呈递细胞角色。肠道处于炎症状态时，循环中大量单核细胞被招募至固有层，发育成巨噬细胞[6]，肠道巨噬细胞大都源于此。当肠道受病原体侵袭，肠道黏膜层巨噬细胞通过Toll样受体(TLR)清除病原体[7]。除此之外，黏膜层巨噬细胞也具备清除凋亡组织及免疫调节功能。

NAFLD与巨噬细胞的研究多聚焦于Kupffer细胞以及骨髓来源肝脏单核巨噬细胞，关于NAFLD与肠道巨噬细胞的报道较少。Tsujimoto等[8]发现，在NASH大鼠回肠组织中，包括巨噬细胞在内的免疫细胞数量明显增加，通过TLR4信号介导的固有免疫应答增强，TNFα表达上调，说明肠道免疫和肝脏相互作用参与了NASH发生。Imajo等[9]也发现，NASH小鼠肝脏CD14及TLR4阳性巨噬细胞数量明显增加，该类细胞对低剂量肠源性脂多糖呈现过度反应。相关研究[10]说明，在NAFLD发病过程中，肠道固有免疫被激活，同时其下游肝脏固有免疫也呈现活化状态，大量骨髓源性单核细胞被募集至肝脏，促进肝脏炎症、纤维化，而肠源性巨噬细胞在该过程中发挥重要作用。在诸如NAFLD的胆汁淤积发生过程中，肠道巨噬细胞通过炎症小体的激活，促进肠道通透性增加和肠道微生态改变，导致进入肝脏的内毒素增加，参与了胆汁淤积介导的肝细胞死亡和炎症。

肠道菌群对于维持巨噬细胞依赖的肠道免疫稳态至关重要，这一过程主要由短链脂肪酸(short-chain fatty acid, SCFA)调控[11]。在NAFLD发病过程中，肠道菌群失调所致的SCFA含量异常可能是导致肠道巨噬细胞数量及表型发生变化的机制之一。丁酸可以增加肠道巨噬细胞的氧自由基产生和抗菌物质分泌，使其抗菌能力增强[12]。SCFA可以明显下调NASH中肠道巨噬细胞的肝脏募集及肝脏炎症反应，SCFA改善NASH肝脏脂肪变性和炎症，不仅与SCFA作用于肝脏巨噬细胞有关，也可能与调控肠道巨噬细胞有关[13]。

1.2 NAFLD与肠道树突状细胞(DC) DC是唯一能直接激活初始T淋巴细胞的专职抗原呈递细胞。作为肠道专职抗原呈递细胞的DC通过多种模式识别受体对肠道微生物群进行识别和应答[14]。DC在肠壁全层均有分布，除呈递抗原外，还具备免疫调节功能，参与免疫耐受的诱导和维持[15]。

肝脏DC参与NAFLD的肝脏脂肪变性、炎症及纤维化[16]。在慢性炎症环境中，肝脏DC转化为强效免疫反应诱导物，参与肝脂质沉积，是NAFLD进展机制之一[17]。此外，某些肝脏DC亚型，如CD103+cDC以及CD11c+MHCⅡ+DC对NAFLD肝脏炎症环境具有免疫调节作用，保护肝脏免受代谢性损伤[18-19]。有关NAFLD对肠道DC的影响，现有研究结论尚未统一。Tsujimoto等[8]发现，NASH大鼠回肠组织DC数量明显增加，肠道固有免疫呈过度活化状态。国内学者[20]却发现，小鼠肠道DC与NAFLD发生发展相关，即在NAFLD早期阶段，小肠DC数量明显升高，随着疾病进一步发展，DC数量未再明显变化。这一现象可能与以下原因有关：在NAFLD早期，肠道稳态被破坏导致炎性抗原增多，负责肠道适应性免疫应答始动阶段的DC数目随之增加，但随着病情发展，肠道适应性免疫应答转换为效应阶段，肠道DC数量未再变化。笔者研究[21]发现，在单纯性脂肪肝和NASH大鼠中，CD103+MHCⅡ+DC占肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node, MLN)总细胞的比率较对照组明显降低，并且该比率与疾病严重程度、门静脉脂多糖水平呈相反的变化趋势。该结论可能与MLN中大部分均为免疫细胞，DC变化的同时其他免疫细胞发生变化，并且变化幅度更大有关。

在NAFLD中，肠道屏障完整性受损以及肠道菌群紊乱与肠道DC失调密切相关。DC通过分泌IL-10，抑制辅助性T淋巴细胞(Th)17介导的炎症反应，以此保护肠道屏障完整性[22]。另外，肠道菌群的代谢产物能够调节肠道DC功能。有学者[23-24]发现，SCFA能够调节单核细胞来源的DC表型分化、成熟过程和免疫功能，包括细胞因子分泌、抗原捕获能力以及对T淋巴细胞的刺激作用。作为法尼酯受体激动剂的次级胆汁酸能够通过抑制NF-κB转录通路调节肠道DC功能[25]。

1.3 NAFLD与肠道固有淋巴细胞(innate lymphoid cells, ILC) ILC主要分布在肠道固有层，具有维持肠道稳态和抵御病原体的功能。ILC表达多种细胞因子受体，但不表达抗原特异性受体，不会对病原体抗原直接做出反应。ILC分为自然杀伤细胞(NK细胞)、1型ILC(ILC1)、2型ILC(ILC2)、3型ILC(ILC3)和淋巴组织诱导细胞。

在肝脏组织中，NK细胞数量约占肝脏淋巴细胞30%～50%，分为组织固有NK细胞和循环NK细胞(circulated NK cells, cNK细胞)。肝脏CD49+NKp46+cNK细胞通过促进巨噬细胞极化来改善NASH纤维化[26]。Fan等[27]发现，肝脏cNK细胞增多可以改善肝脏CD45+CD11bhiF4/80int单核细胞源性巨噬细胞的炎症浸润。当肠道感染后，小肠NK细胞对病原体做出免疫应答，通过分泌IFNγ发挥作用[28]。ILC2表达转录因子GATA-3，分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-13，在抗寄生虫、组织修复和过敏反应中发挥作用。Forkel等[29]发现，肝纤维化的肝组织内ILC2数量增高，其表型与外周血ILC2不一致，其通过分泌IL-13激活肝星状细胞促进肝纤维化。ILC3是肝脏ILCs中占比最多的一类，且大量定居在肠道中。ILC3表达转录因子RORγt并分泌淋巴毒素α1β2、IL-17A、IL-22、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和TNFα。肝纤维化过程中，肝脏IL-17A+及IL-22+ILC3亚型具有促纤维化作用[30]。有关NAFLD对肠道ILC的影响及调控尚未见系统报道。

1.4 NAFLD与肠道T淋巴细胞 肠道T淋巴细胞识别抗原后，活化并迁移至MLN，经淋巴或血液循环发育为效应T淋巴细胞，分布于肠道和其他器官介导细胞免疫应答，小部分T淋巴细胞发育为记忆性T淋巴细胞。CD4+T淋巴细胞发挥免疫辅助作用，调节适应性免疫应答；CD8+T淋巴细胞发挥细胞毒作用，且对CD4+T淋巴细胞产生免疫抑制的调节作用[31]。肠道T淋巴细胞主要定居于肠相关淋巴组织及MLN中，一部分CD8+T淋巴细胞分布于肠道上皮层。

在NAFLD发病过程中，侵入肠道的抗原能够激活全身及肠道细胞免疫反应。研究[32]发现，NAFLD外周血单个核细胞(periphera blood mononuclear cells, PBMC)及派伊尔结(Peyer’s Patch, PP)的CD4+/CD8+T淋巴细胞比值呈现动态变化：在NAFLD早期阶段，PBMC及PP中CD4+T淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞比值均明显增高，提示全身以及肠道细胞免疫应答均处于增强状态；随着NAFLD进展，比值呈下降趋势，而门静脉中脂多糖水平升高，提示机体免疫系统受损，炎症范围进一步蔓延；当进展到NASH阶段，PBMC中的CD4+与CD8+T淋巴细胞比值和门静脉中脂多糖的水平恢复正常，但是PP中该比值仍然是升高的，反映了肠道持续性的慢性炎症状态。研究者[33]还发现，NAFLD小鼠MLN内包括Th1和Th17的CD4+T淋巴细胞数量较正常对照组明显增多，而Th2和调节性T淋巴细胞(Treg)数量却显著减少；进一步分析其比例发现，Th1/Th2和Th17/Treg均明显升高。该研究提示，在NAFLD发病过程中，肠道促炎反应和抗炎反应之间的微妙平衡被打破，肠道免疫处于失衡状态。Jiang等[34]却发现，NAFLD患者的十二指肠组织固有层的CD4+和CD8+T淋巴细胞较正常患者明显减少，而促炎因子TNF、IL-6和 IFNγ表达水平增高。该临床研究结果与其他结果不一致，可能与血清脂多糖水平、物种、取材部位和疾病严重程度有关。

作为肠道菌群代谢产物，SCFA对T淋巴细胞的生理活动产生重大影响。丁酸刺激T淋巴细胞分化为Treg，乙酸和丙酸可以刺激常驻结肠组织Treg增殖[35]。在NAFLD中，肠源性内毒素血症引起循环及肝脏内毒素水平升高，当内毒素被巨噬细胞或单核细胞呈递给初始CD4+T淋巴细胞后，能够上调IL-17表达，这可能是肠道及肝脏Th17数量增加的机制之一，而肝脏中增高的Th17促进NAFLD肝脏炎症及纤维化，加速单纯性脂肪肝向NASH转变[36-37]。相比于骨髓、脾脏和胸腺源性的淋巴细胞，肠源性CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞更趋向于再循环至肝脏，通过分泌炎症因子和刺激吞噬细胞分化等途径介导肝脏炎症反应，促进NAFLD病程发展，这可能与肝细胞趋化因子CCL5表达升高以及MLN内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及CD19+B细胞淋巴表面CCR3高表达有关[38]。

1.5 NAFLD与肠道B淋巴细胞 肠道B淋巴细胞骨髓源性B2细胞和由腹腔迁移而来的B1细胞。与B1细胞产生的非T淋巴细胞依赖性IgA相比，B2细胞产生的T淋巴细胞依赖性IgA在与抗体结合时具有更高特异性和亲和能力[39]。在NAFLD中，肝脏B淋巴细胞常发生在T淋巴细胞活化之前，通过产生炎症介质和抗体促进肝小叶的炎症及纤维化，加快病程发展[40]。在肠道抗原刺激下，肝脏B淋巴细胞的IgA进入肠道，同时肠源性产IgA的B淋巴细胞至肝脏，参与肝脏体液免疫[41]。通过肠肝循环，肝脏及肠道B淋巴细胞交集。

关于NAFLD与肠道B淋巴细胞究非常少，更多研究是关于NAFLD和肠道IgA之间的关系。在NAFLD中，肠道IgA水平明显降低，其变化可能与肠源性内毒素血症、疾病的严重程度相关。Li等[42]发现，NASH大鼠肠道黏液中的SIgA水平明显降低，门静脉中内毒素水平升高，两者呈负相关。NASH小鼠的粪便标本中IgA水平明显降低，回结肠组织中IgA阳性细胞也明显减少，但在单纯性脂肪肝阶段，小鼠粪便IgA水平和回结肠IgA阳性细胞数量相对于对照组并无显著差异，这似乎表明NAFLD肠道IgA水平与疾病严重程度负相关，粪便IgA水平可以预测疾病严重程度[43]。然而血清IgA水平与NAFLD严重程度正相关，即随着NAFLD病情加重，血清IgA水平也随之升高[44]。

肠道IgA能够影响肠道菌群变化，而肠道IgA也受肠道菌群调控[45]。在缺乏B淋巴细胞的粪便中，肠肝菌科数量明显增加[46]。将低粪便IgA水平小鼠和高粪便IgA水平小鼠共同饲养或者通过粪便移植的方式使肠道菌群垂直转移后，高粪便IgA小鼠的粪便IgA水平明显降低[47]，提示肠道IgA水平受肠道菌群调节。益生菌通过提高肠道IgA水平以及肠黏膜内IgA阳性细胞数量来改善肠道免疫紊乱，缓解NAFLD病程[43]。NAFLD肠道IgA下降，肠道埃希氏杆菌属(属于肠杆菌科)丰度却较对照组明显增加[34]。与正常及肥胖儿童相比较，在纲水平上，NAFLD儿童肠道变形菌(肠杆包含菌科)明显增多[48]。据此推测，NAFLD肠道IgA水平可能与肠杆菌科失衡相关。

肠道菌群代谢产物SCFA与肠道IgA水平也密切相关。人粪便中的丁酸浓度与IgA水平呈正相关，丁酸能够增强IgA免疫效应[49]。SCFA能够调节B淋巴细胞代谢，如增加氧化磷酸化、糖酵解及游离脂肪酸合成，使得线粒体产生更多能量参与B淋巴细胞、分化和抗体生成[50]。NAFLD的肠道B淋巴细胞IgA水平的变化可能受上述机制所影响。

2 以肠道免疫为靶点治疗NAFLD

从肠道免疫的角度治疗NAFLD已成为当下研究热点。一些药物可以通过口服给药途径靶向调节肠道免疫系统，进而改善NAFLD。现阶段抗CD3单克隆抗体、PRX106(重组抗TNFα融合蛋白)已经进入临床试验阶段。

抗CD3单克隆抗体(anti-CD3 monoclonal antibody, Anti-CD3 mAb)口服后不被肠道吸收，但能够影响肠道免疫，将免疫信号传递至全身免疫系统。Anti-CD3 mAb口服后被固有层中的DC摄取，随DC迁移至MLN诱导Treg的分化，从而调节全身免疫状态。口服Anti-CD3 mAb诱导Treg和NKT淋巴细胞抑制炎症反应，减少肝脏脂质蓄积、减轻炎症改善、病情[51]。健康志愿者及NASH患者在口服Anti-CD3 mAb后有良好安全性、耐受性以及生物活性[52]。

PRX106是一种重组抗TNFα融合蛋白，口服后不被胃肠道吸收，能够改善免疫相关的肝脏损伤和结肠炎，该过程与CD4+CD25+Foxp3+Treg分布有关[53]。口服PRX106可以降低NASH小鼠的血清甘油三酯、葡萄糖、胰岛素和AST水平，改善肝损伤[54]。在此过程中，肠道免疫信号对肝脏免疫系统乃至全身免疫系统产生影响，具体机制尚不清楚。临床试验表明健康志愿者口服PRX106后有良好的安全性、耐受性以及生物活性[55]。

3 问题与展望

目前，有关NAFLD发病中肠道免疫系统变化的趋势、机制尚未明确，大部分研究结论均建立在NAFLD模型基础之上，其与真实世界的一致性仍面临重大挑战。在NAFLD中肠道免疫系统失衡是存在的，不同免疫细胞变化伴随着疾病发展与全身免疫系统紊乱，其中肠道菌群紊乱可能是NAFLD中肠道免疫紊乱的机制之一。目前NAFLD尚无特效药物，而肠道免疫细胞作为NAFLD的治疗靶点，具有较好的前景，其中Anti-CD3 mAb和PRX106的口服给药可以通过调节肠道局部的免疫环境，进而改善全身免疫环境及肝脏的免疫环境来治疗NAFLD。

总之，肠道免疫失衡参与了NAFLD发生与发展，探究肠道免疫的角色有助于对NAFLD发病机制以及治疗的研究，而口服免疫制剂的应用为治疗NAFLD提供了新手段。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：雷亚兰负责课题设计，撰写论文；毕俭负责参与修改论文；毛靖伟负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。