Rac1在食管鳞状细胞癌中的研究进展

郭丽媛，张金业

(1.南通大学医学院，江苏南通 226001；2.南通大学附属肿瘤医院检验科，江苏南通 226001)

食管癌具有高发病率、高致死率的特征，是临床上常见的恶性肿瘤之一[1]。从组织学类型上，食管癌可分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)。尽管食管癌的治疗方法不断进步，但依据癌症中心数据显示，食管癌5年生存率仅为20%[2]。目前临床上ESCC尚未有明确的分子靶向药物，因此，需进一步寻找更有效的肿瘤标志物以实现早诊断、早治疗，降低患者死亡率。Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)作为Rho家族成员之一，是一种鸟嘌呤核苷酸激活蛋白(GTP)酶[3]。研究表明，Rac1在乳腺癌、肝癌和肺癌等肿瘤中呈高表达，且与预后不良有关，可作为有效的治疗靶点[4-6]。近年来研究发现，Rac1在ESCC中呈高表达，并与ESCC的发生、发展和转移密切相关[7]。本文就 Rac1在ESCC发生、发展和转移过程中的分子调控机制、Rac1基因的检测技术以及临床治疗中的应用作一综述。

1 Rac1的结构及功能

Rac1基因位于人染色体7p22，含有7个外显子和3个内含子。该基因编码的蛋白质是GTP酶(GTPase)，属于小GTP结合蛋白Ras超家族[8]。该超家族的成员调控着一系列不同的细胞事件进程，包括控制细胞生长、细胞骨架重组和蛋白激酶的激活等。Rac1蛋白包括核苷酸结合位点、开关一、开关二、多碱基区和C-末端膜靶向区域5个结构域，任意1个出现错义突变即可导致肿瘤的发生。Rac1有2种存在形式，分别为可被鸟嘌呤核苷酸交换因子激活至 GTP 结合状态，以及被GTPase失活至 GDP 结合状态。在其 GTP结合状态下，在多种细胞互相作用的过程(如细胞的生长、转移、侵袭、凋亡、周期调控和细胞骨架重组等)中起着重要作用[9]。Rac1 及其细胞信号网络可对肿瘤产生以下5种作用：抗凋亡、促增殖、转移相关的上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)、癌症干细胞和促血管生成。

2 Rac1检测技术的研究进展

研究表明，Rac1表达的量及活性均影响肿瘤的发生、发展。因此，Rac1的早期检测可为肿瘤的诊治提供重要的临床应用价值。

2.1Rac1蛋白和基因表达的检测技术 主要包括：实时荧光定量RT-PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)、蛋白质免疫印迹(western blot)技术以及免疫荧光技术(immunofluorescence，IF)。IHC、western blot、IF都是利用抗原抗体反应对基因进行定量或定位的检测手段，检测方法较简单，特异性高，定位准确，但对仪器的要求比较高。例如，Yang等[7]采用RT-PCR、western blot和IHC技术发现Rac1在ESCC组织中的蛋白质及基因水平的表达上调，并且证实了Rac1的高表达与肿瘤的侵犯深度、淋巴结转移和低存活率相关。Yuan等[10]采用IF技术证实了Rac1在ESCC细胞中主要定位于细胞质，并发现Rac1越聚集在细胞膜前缘，则肿瘤细胞的迁移能力越强。对Rac1检测定量分析最准确的检测方法是qRT-PCR，该技术的灵敏度高、准确性强，但qRT-PCR结果的影响因素很多，如重复洗涤、离心、纯化等步骤均可造成相当数量的核酸损失。目前开发的基于液滴的数字PCR(dPCR)技术可避免上述缺陷，在 dPCR中，样品被稀释，每个单独的分区包含不超过1个目标序列，dPCR提供了绝对值和可分析的定量数据，极大地提高了稀有序列检测的灵敏度、特异性，克服了肿瘤细胞低核酸的缺点[11]。目前国内尚未见采用dPCR检测ESCC患者Rac1表达的研究报道。尚需更深层次研究，为在早期阶段检测肿瘤标志物提供实验依据。

2.2Rac1活性的检测技术 谷胱苷肽巯基转移酶下拉法(Glutathione-S-transferase pull down assay，GST pull down assay)是目前临床上常用的检测Rac1活性的方法。GTS-pull down法主要利用某些蛋白质的结构域能够与GTP-Rac1相结合的特性，构建出该结构域的GST融合蛋白，通过GST-pull down方法富集激活形式的Rac1，并且能够动态反映细胞内Rac1的活性变化，具有较高的准确性和特异性，但偶尔会出现假阳性结果[12]。Yuan等[10]采用GTS-pull down法检测Rac1在ESCC组织中的活性，证实Rac1活性越高，迁移能力则越强。其进一步研究发现，Rac1与肿瘤的进展呈正相关，且在发生肿瘤转移的患者中，Rac1的表达水平比未发生转移患者明显升高，且预后较差。但由于现有检测技术的限制，尚未见在外周血中能检测Rac1的活性变化的报道。因此，还需进一步深入研究Rac1活性的检测技术及临床应用价值。

3 Rac1与ESCC的发生、发展及转移

3.1Rac1促进ESCC发生、发展和转移 Rac1蛋白高表达与Rac1基因突变及活性异常有关。有学者发现，Rac1突变体的形成及其上游分子异常启动可使活性增强，从而启动一系列信号通路，导致肿瘤的发生、发展[13]。另有研究表明，小GTPase Rac1参与了F-肌动蛋白和黏着斑动力学，导致肌动蛋白在前沿聚合产生突起，过度激活的Rac1可增强细胞迁移[14]。肌动蛋白细胞骨架动态组装成丝状体和微梭形结构启动了细胞迁移，Rac1的表达和激活可促进此进程。此外，EMT与肿瘤的转移密切相关。目前研究表明，Rac1与EMT关系密切，Rac1可通过以下几种途径实现EMT，从而促进肿瘤的转移，包括：其上游效应物过表达/过活性(生长因子)；下游效应物激活P21活化蛋白激酶(p21-activated kinases，PAK)；Rac1活性增加；间接变异体(如Rac1b)表达；上调Wnt/β-连环蛋白途径；激活转录激活因子3；促进肌动蛋白细胞骨架片状足形成；促进活性氧类(reactive oxygen species，ROS)产物形成及应激反应蛋白(如p38)的激活[9]。通过以上机制，Rac1不仅促进肿瘤细胞的生长、发展，也促进了肿瘤的转移。

3.2Rac1促进ESCC转移的信号通路 有学者发现，一种新的天然大环内酯F806可下调Rho家族(CDC42、Rac1)的表达和活性，从而中断F-肌动蛋白迁移成分的组装，抑制癌症的侵袭和转移[15]。另有研究发现，在ESCC中，Rac1的表达受趋化因子基质细胞衍生因子-1的趋化因子受体(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)的调节，敲低CXCR4可显著抑制AKT和ERK的磷酸化以降低Rac1蛋白的水平，从而抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移[16-17]。研究证实，微小核糖核酸(miRNA)在细胞增殖、细胞生长、凋亡、DNA修复、侵袭、血管生成、转移和耐药中均具有重要作用[18]。Ma等[19]研究发现，MicroRNA-92b在ESCC中呈高表达，且与淋巴结转移呈负相关，其进一步证实MicroRNA-92b可通过抑制整合素αV 的表达发挥其抑制功能，降低了磷酸化黏着斑激和Rac1的激活，从而影响侵袭与迁移。Tanabe等[20]通过免疫组织化学证实，Rac1的活性受丝状蛋白C(filamin C，FLNC)的调节，FLNC在ESCC中的表达与淋巴侵袭、转移和预后有关，FLNC可激活Rac1，使细胞侵袭、迁移能力增强。Wen-Jian等[21]发现，在ESCC中，14-3-3ε基因与T 淋巴瘤侵袭转移诱导因子1的结合可促进Rac1的激活。Wang等[22]发现，球姜酮(Zerumbon,ZER)可通过促进Rac1泛素化，导致Rac1的降解，抑制ESCC的迁移。以上研究证实，Rac1对ESCC的影响主要为上游分子导致Rac1的激活或表达增加，从而促进肿瘤转移，如若Rac1降解，则对肿瘤的进程产生抑制作用。

4 Rac1在抗肿瘤治疗中的应用

研究表明，Rac1抑制剂在抗肿瘤的疗效评价中具有较高的临床应用价值，针对Rac1的放化疗方案、靶向治疗及免疫治疗均取得了较好的疗效[23]。Rac1抑制可逆转乳腺癌的顺铂耐药[24]；在非小细胞肺癌中，Rac1诱导的EMT与增强的癌细胞迁移和侵袭相关，并与放疗抵抗密切相关[25]；对于靶向治疗，Rac1的激活可增加肺癌对吉非替尼的耐药性[26]。此外，研究表明，抑制Rac1能够阻碍肿瘤细胞的免疫逃逸[27]。由此可见，Rac1抑制剂在肿瘤治疗中具有重要的临床应用价值。Xu等[28]发现，整合素β1通过调节FAK-Rac1信号通路促进细胞活性，并下调ESCC细胞对顺铂的敏感性，表明整合素β1可作为ESCC治疗靶点。笔者推测，阻断Rac1信号通道的传导可增强ESCC对顺铂的敏感性，但尚需进一步的临床研究证实。

5 小结及展望

RAC1广泛表达于肿瘤细胞中，Rac1的突变与活性异常在ESCC的发生、发展及转移中发挥重要的作用。随着检测技术的不断进步，目前已开发出多种技术用于Rac1的表达及活性的检测，但仍需要研发新型检测技术以提高Rac1的检出率，为早期诊断和早期治疗提供新的依据。通过研究Rac1的结构、功能及其调控的信号通路，有望为ESCC分子靶向药物治疗提供新途径。因此，对Rac1进行更深层次的认识及靶向调控的研究，可为新型抗肿瘤靶向药物的开发提供重要的实验依据，为ESCC的临床治疗提供更多的选择，为改善肿瘤患者病情及提高存活率带来新希望。