知百安神口服液抗抑郁作用及机制研究Δ

虞慧华，蔺红伟，庞 涛，李铁军，陆文铨，朴淑娟#

(1.海军军医大学长海医院药剂科，上海 200433； 2.海军军医大学长征医院药剂科，上海 200003； 3.海军军医大学药学院药理学教研室，上海 200433)

抑郁症是临床常见疾病之一，作为目前严重影响人类身心健康的精神性疾病，其具有较高的发病率和复发率。据世界卫生组织推测，抑郁症现已成为导致人类死亡和残疾的第二大类疾病[1]。百合知母汤源自张仲景的《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病脉证并治第三》，由知母和百合2味中药组成，有养阴清热、除烦润燥之效，主治百合病[2]。现代研究结果认为，抑郁症与中医百合病有极大的相似性[3]。百合知母汤是中医药治疗抑郁症、失眠和焦虑等精神神经性疾病的经典方药[4]。知百安神口服液源自于百合知母汤，作为院内制剂在海军军医大学长征医院临床使用多年，用于抑郁症、失眠等症的治疗，疗效显著。本研究利用经典的抑郁症动物模型[5-6]，对知百安神口服液抗抑郁药理活性进行研究，为开发出高效、低毒的新型抗抑郁中药提供有力的技术支撑。

1 材料

1.1 仪器

YLS-1A型多功能小鼠自主活动记录仪(济南益延科技发展有限公司)；圆柱形玻璃缸(高20 cm，直径14 cm，自制)。

1.2 药品与试剂

知百安神口服液(浸膏粉，批号为190820，每克干粉含有生药材16.6 g，海军军医大学长征医院制剂室制备)；盐酸氟西汀胶囊(礼来苏州制药有限公司，批准文号为国药准字J20170022，规格为20 mg/粒，批号为9847A)；舒肝解郁胶囊(四川济生堂药业有限公司，批准文号为国药准字Z20174037，规格为0.36 g/粒，批号为200113)；盐酸安非他酮片[万特制药(海南)有限公司，批准文号为国药准字H20070209，规格为75 mg/片，批号为20191101]；盐酸文拉法辛缓释片[成都康弘药业集团股份有限公司，批准文号为国药准字H20070269，规格为75 mg(按C17H27NO2计)，批号为0D010]；甲磺酸瑞波西汀(北京伊诺凯科技有限公司，CAS为98769-84-7，产品编号为R129930,规格为10 mg/瓶，批号为F1501133)；甲磺酸雷沙吉兰片[灵北(北京)医药信息咨询有限公司，进口药品注册证号为H20170336，规格为1 mg(以雷沙吉兰计)，批号为R89078]；盐酸多巴胺(德国Sigma-Aldrich公司，产品编号为H8502,规格为5 g/瓶，批号为BCCB2491)；利血平(德国Sigma-Aldrich公司，产品编号为83580,规格为1 g/瓶，批号为WXBD0706V)；5-羟色胺酸(5-HTP，阿法埃莎化学有限公司，规格为1 g/瓶，批号为10225028)； L-去甲肾上腺素(美国Aladdin Industrial公司，CAS为 51-41-2，产品编号为N109573，规格为1 g/瓶，批号为C1905140)；育亨宾(美国Aladdin Industrial公司，CAS为 65-19-0,产品编号为Y111137，规格为5 g/瓶，批号为J1526063)；盐酸色胺(德国Sigma-Aldrich公司，CAS为61-54-1,产品编号为193747，规格为10 g/瓶，批号为BCCC5416)；羧甲基纤维素钠(CMC-Na，国药集团化学试剂有限公司，规格为500 g/瓶，批号为F20050302)。

1.3 实验动物

ICR小鼠，雄性，体重18～20 g，SPF级；SD大鼠，雄性，体重180 g，SPF级。实验动物购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[实验动物质量合格证号：SCXK(沪)2018-0006]。所有动物均自由觅食和饮水，在室温(23 ℃±2 ℃)、自然光照条件下饲养。

2 方法

2.1 分组与给药

绝望模型实验设阴性对照组，阳性对照组[包括疏肝解郁胶囊组(0.576 g/kg)、盐酸氟西汀胶囊组(8 mg/kg)]，知百安神口服液低、中和高剂量组(0.36、0.72和1.44 g/kg)。利血平拮抗模型实验加设特异性阳性对照组：盐酸文拉法辛缓释片组(90 mg/kg)。抑制单胺重摄取实验加设阳性对照组：盐酸安非他酮片组(120 mg/kg)、甲磺酸瑞波西汀胶囊组(3.2 mg/kg)。

抑制单胺氧化酶实验以大鼠作为实验对象，设阴性对照组，阳性对照组[包括疏肝解郁胶囊组(0.288 g/kg)、盐酸氟西汀胶囊组(4 mg/kg)]，知百安神口服液低、中和高剂量组(0.18、0.36和0.72 g/kg)，并加设特异性阳性对照组甲磺酸雷沙吉兰片组(2 mg/kg)。

实验动物随机分组，每组10只动物，1日灌胃1次，灌胃量0.1 ml/10 g，连续给药7 d。溶剂为0.5% CMC-Na溶液，临用前配制，充分搅匀后灌胃。

2.2 小鼠绝望模型实验

2.2.1 小鼠悬尾实验：末次给药1 h后，将小鼠尾端2 cm部位固定在一水平木板上，使动物成倒挂状态，木板放置于一敞口箱内，其头部离底面约5 cm。实验持续6 min，观察记录后4 min内小鼠的不动时间[7-8]。

2.2.2 小鼠强迫游泳实验：末次给药1 h后，将小鼠放入高20 cm、直径14 cm的圆柱型玻璃缸中，缸内水深10 cm，水温23～25 ℃。从小鼠入水后持续6 min，记录后4 min内累积的不动时间[9-10]。

2.3 利血平拮抗模型实验

末次给药1 h后，腹腔注射利血平3.8 mg/kg，观察小鼠1 h后15 s内的眼睑下垂情况。分级标准：0度，正常开目；1度，眼睑下垂 1/4；2度，眼睑下垂 1/2；3度，眼睑下垂 3/4；4度，眼睑完全闭合[11-13]。

2.4 抑制单胺重摄取实验

抗抑郁药如果能阻断神经组织对生物胺的重摄取，就会增强外源性去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)等的作用，致使动物出现毒性、死亡等[14-15]。

2.4.1 多巴胺毒性增强实验：末次给药1 h后，小鼠尾静脉注射亚致死剂量(130 mg/kg)的DA，观察24 h内小鼠的死亡数，计算死亡率。

2.4.2 5-HTP诱导甩头实验：末次给药1 h后，腹腔注射150 mg/kg的5-HTP，注射5-HTP后5 min，开始记录15 min内小鼠的甩头次数。

2.4.3 NE毒性增强实验：末次给药1 h后，小鼠皮下注射亚致死剂量(10 mg/kg)的NE，观察24 h内小鼠的死亡数，计算死亡率。

2.4.4 育亨宾毒性增强实验：末次给药1 h后，小鼠皮下注射育亨宾50 mg/kg，观察24 h内小鼠的死亡情况，计算死亡率[16]。

2.5 抑制单胺氧化酶实验

末次给药1 h后，尾静脉注射盐酸色胺(12 mg/kg)，观察注射后5 min内大鼠前肢是否出现拍打动作和弓背阵挛状态，并且根据其激烈程度进行评分。评分标准为：未出现拍打动作，0分；间断性拍打动作，1分；持续性拍打动作，伴有弓背现象，2分；出现痉挛现象，3分[17-18]。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 知百安神口服液对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响

小鼠在悬尾和强迫游泳过程中出现行为绝望，表现为不动状态。与阴性对照组比较，知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠悬尾、强迫游泳不动时间明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)；与阴性对照组比较，阳性对照组(舒肝解郁胶囊组和盐酸氟西汀组)小鼠悬尾和强迫游泳不动时间明显缩短，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 知百安神口服液对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响(n=10)

3.2 知百安神口服液对利血平致小鼠抑郁模型的影响

小鼠腹腔注射利血平3.8 mg/kg可引起小鼠眼睑下垂，眼睑下垂度为3.10±1.29。与阴性对照组比较，知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠眼睑下垂度明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，且有一定的浓度依赖趋势；与阴性对照组比较，舒肝解郁胶囊、盐酸氟西汀组和盐酸文拉法辛缓释片组小鼠眼睑下垂度明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 知百安神口服液对利血平致小鼠抑郁模型的影响(n=10)

3.3 知百安神口服液对亚致死剂量DA致小鼠死亡的影响

阴性对照组小鼠尾静脉注射亚致死剂量(130 mg/kg)的DA，死亡率为10%；盐酸安非他酮片组小鼠静脉注射亚致死剂量DA的死亡率为60%，较阴性对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；盐酸氟西汀组、舒肝解郁胶囊组小鼠静脉注射亚致死剂量DA的死亡率(20%)有所升高，与阴性对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；知百安神口服液低、中和高3个剂量组小鼠静脉注射亚致死剂量DA的死亡率有所升高，与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 知百安神口服液对亚致死剂量DA致小鼠死亡的影响(n=10)

3.4 知百安神口服液对5-HTP诱导小鼠甩头的影响

腹腔注射150 mg/kg的5-HTP可诱导小鼠甩头行为，盐酸氟西汀组和舒肝解郁胶囊组小鼠甩头次数较阴性对照组明显增加，差异有统计学意义(P<0.01)，表明阳性对照药能高度选择性抑制突触前膜对5-HT的再摄取，提高中枢内5-HT的浓度，因此明显增加5-HTP诱导的小鼠甩头行为。知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠的甩头次数均增加，且有剂量依赖趋势；其中知百安神口服液高剂量组小鼠的甩头次数显著增加，与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 知百安神口服液对5-HTP诱导小鼠甩头的影响(n=10)

3.5 知百安神口服液抑制NE再摄取的作用

阴性对照组小鼠皮下注射亚致死剂量的NE，死亡率为20%；皮下注射育亨宾50 mg/kg后，死亡率为10%。甲磺酸瑞波西汀组小鼠皮下注射亚致死剂量NE和育亨宾后的死亡率明显升高，与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠皮下注射亚致死剂量NE和育亨宾后的死亡率较阴性对照组升高，且知百安神口服液中、高剂量组与阴性对照组的差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表5 知百安神口服液对小鼠皮下注射亚致死剂量NE和育亨宾后的影响(n=10)

3.6 知百安神口服液抑制单胺氧化酶的作用

大鼠在静脉注射盐酸色胺(12 mg/kg)后大多可表现出明显的前肢拍打和伴有弓背现象。甲磺酸雷沙吉兰片组大鼠的评分与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；分析其原因，甲磺酸雷沙吉兰片是单胺氧化酶抑制剂类抗抑郁药，可抑制色胺的代谢而增强静脉注射盐酸色胺引起的大鼠癫痫样发作症状。知百安神口服液中和高剂量组大鼠的评分与阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；分析其原因，知百安神口服液可以加强盐酸色胺引起的大鼠震颤作用，大鼠出现“拍打”的持续时间较阴性对照组长，有一定的浓度依赖趋势，见表6。

表6 知百安神口服液对盐酸色胺引起大鼠前肢痉挛作用的影响(n=10)

4 讨论

抑郁症的形成有几种假说，其中单胺类神经递质假说是抑郁症发病机制研究的基石，对抑郁症发病机制的研究有着举足轻重的作用，单胺类神经递质如5-HT、DA和NE的缺乏与抑郁症的发生有着密切的关系[19]。几十年来，抑郁症治疗药物先后经历了单胺氧化酶抑制剂、三环类抗抑郁药、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI)及新近发展的非典型抗抑郁药。目前，基于调节神经递质研发的抗抑郁药由于起效时间长，可能会降低患者的治疗信心，影响疗效。抗抑郁中药能否缩短起效时间、提高疗效是目前抗抑郁药研究的一个重要方向[20]。

由于目前的主流抗抑郁西药的治疗效果存在局限性，中医药治疗抑郁症日益受到关注，中药及其复方在抗抑郁方面的研究逐渐广泛和深入。相对于西药的临床效应滞后及不良反应大等缺陷，中药及其复方具有多成分、多靶点、多效应、不良反应小、协同作用强和整体调节的特点，在抗抑郁方面具有独特的优势[21]。知百安神口服液来源于张仲景的经典古方百合知母汤，是中医药治疗抑郁症、失眠和焦虑等疾病的经典方药。

小鼠悬尾和强迫游泳实验是抗抑郁药研究的经典动物模型，小鼠在上述2种状态下会很快出现绝望行为，可模拟人类的抑郁状态，抗抑郁药能明显缩短小鼠的不动时间；利血平拮抗模型是最早用于抗抑郁药研究的药物诱导模型，利血平通过消耗脑内儿茶酚胺和5-HT来抑制中枢神经系统，动物注射利血平后会出现上眼睑下垂等表现。本实验中，知百安神口服液能明显缩短小鼠悬尾不动时间和强迫游泳不动时间，显著降低小鼠眼睑下垂度，知百安神口服液低、中和高剂量组与阴性对照比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明知百安神口服液具有抗抑郁作用。作用机制研究中，知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠注射亚致死剂量DA的死亡率均升高，但与阴性对照比较，差异无统计学意义(P>0.05)，说明知百安神口服液对DA的重摄取无明显抑制作用。在5-HTP诱导小鼠甩头实验中，知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠甩头次数均增加，有剂量依赖趋势,与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，说明知百安神口服液具有抑制5-HT再摄取的作用。在NE毒性增强和育亨宾毒性增强实验中，知百安神口服液低、中和高剂量组小鼠的死亡率均升高，且中、高剂量组与阴性对照比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明知百安神口服液具有抑制NE重摄取的作用。盐酸色胺也是一类外源性胺类物质，可引起大鼠前肢痉挛性拍打，单胺氧化酶可使其代谢失活。知百安神口服液可增强盐酸色胺引起的大鼠前肢震颤作用，大鼠出现“拍打”的持续时间较阴性对照组延长，且有一定的浓度依赖趋势，知百安神口服液中、高剂量组大鼠的评分与阴性对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明知百安神口服液具有抑制单胺氧化酶的作用。

综上所述，知百安神口服液具有抗抑郁作用，其作用机制可能与增强脑内5-HT和NE等神经递质并抑制单胺氧化酶的作用有关，可为知百安神口服液临床治疗抑郁症和开发新型抗抑郁中药提供药理学依据。