沉默Galectin-3对人甲状腺乳头状癌细胞增殖、侵袭能力影响及机制研究

胡永全，任 丽，郭道华，袁 超，陶新全，李卫鹏，刘恒超，申 勇，訾 刚

(1.蚌埠医学院第一附属医院核医学科，安徽 蚌埠 233004；2.蚌埠医学院核医学教研室；3.药剂科)

甲状腺癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，甲状腺癌是近年来发病率增长最快的实体恶性肿瘤,其中分化型甲状腺癌占新发甲状腺癌的90 %以上[1]。乳头状癌是分化型甲状腺癌中最常见的组织学类型，目前临床上常见的治疗手段有手术、131I治疗、甲状腺激素替代治疗等，一般预后较好。尽管大多数分化型甲状腺癌患者可以通过手术治愈，通常随后进行131I治疗和促甲状腺激素抑制，但不能切除的局部复发和/或转移性及放射性碘难治性患者的10年生存率低，存活率仅为19 %，治疗难度大[2]。现靶向药物仅能改善碘难治性分化型甲状腺癌的无进展生存期,不提高总生存期，其有一定不良反应，且用药患者的选择及适应证的把握存在困难；用药前后患者的评估、长期随访的评价及撤药原则也缺乏统一标准[3]。以上方法对部分进展期或转移性病灶效果不佳,因此，有必要提高对乳头状甲状腺癌致癌和发展的分子机制的认识,提高对乳头状甲状腺癌的认识可促进其基因治疗的应用，改善患者的预后[4]。探究发病机制寻找治疗新靶点对于提高此类癌症的治疗效果具有更加重要的意义。

半乳糖凝集素-3(Galectin-3)是凝集素家族中重要一员，参与多种细胞的生长、凋亡、周期调控、损伤、修复等过程，并且在多种肿瘤组织中均有表达，与肿瘤组织的恶性程度、肿瘤细胞的浸润、转移密切相关[5]。本研究采用沉默人甲状腺乳头状癌细胞(Human papillary thyroid carcinoma cells，B-CPAP)的Galectin-3表达，初步探讨Galectin-3在B-CPAP增殖、侵袭中的作用。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 B-CPAP细胞株购买于上海拜力生物公司，RPMI-1640培养基购于Gibco北京生物有限公司公司，10 %胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，小干扰RNA(si-NCAPG)购于上海吉玛公司，Lipofectamine TM2000试剂盒、MTT试剂盒购于TAKARA大连有限公司；Western blot使用抗体：半乳糖凝集素-3(Galectin-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、凋亡抑制基因(Survivin)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metallopeptidase 9,MMP-9)及内参基因(β-actin)单克隆抗体购于Sigma公司，合肥志宏生物技术有限公司销售。

1.2Galectin-3 siRNA转染B-CPAP及转染后细胞中Galectin-3的表达 实验细胞为对数生长期细胞，在转染前1 d将细胞浓度调整至1×106个/孔浓度，接种于6孔板中每孔2 mL,当细胞融合度达到50 %左右时按照Lipofection TM 2000试剂盒说明书对空白对照组(Control,仅加入脂质体)、NC-siRNA组(非特异性siRNA，不具有任何干扰作用)、Galectin-3-siRNA1组、Galectin-3-siRNA2组的B-CPAP进行转染。转染并进行培养48 h后，收集细胞并检测各组Galectin-3表达情况，实验重复3次。

1.3噻唑蓝[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide,MTT]法监测Galectin-3-siRNA转染后B-CPAP增殖情况 将对数生长期细胞接种于96孔板中，每组细胞设置3个复孔，放置培养箱中培养24 h,换液后继续培养48 h,每孔加入MTT液20 μL继续放入培养箱中，4 h后取出，弃去上清并每孔加入150 μL DMOS，待细胞完全裂解后，用酶标仪于490 nm检测每孔的吸光度值，重复实验3次，取平均值。细胞抑制率(%)=(对照组吸光度值-实验组吸光度值)/对照组吸光度值×100 %。

1.4Transwell小室测各组细胞侵袭率 按文献[6]的方式，取Transwell小室，4 ℃预冷，PBS缓冲液(1∶8配置Matrigel胶液)，将100 μL胶液从小室内缓慢注入完成辅胶，37 ℃放置30 min备用。向24孔板中注入含有10 %胎牛血清的培养液600 μL/孔，将小室置入24孔板中同时向小室中加入100 μL细胞混悬液，低氧下继续培养48 h,除去未穿膜细胞、固定、染色。镜下随机读取10个视野，计算膜背侧的穿膜数(侵袭率 = 低氧组穿膜细胞数/常氧组穿膜细胞数 × 100 %)。

1.5Galectin-3-siRNA转染后检测B-CPAP中相关蛋白表达情况 取对数期生长细胞接种至96孔板中，每孔200 μL，置入培养箱中24 h,按Lipofection TM 2000试剂盒说明书分组转染，收集转染后48 h的细胞(包括加入脂质体的空白对照组)，利用蛋白裂解液将各组细胞裂解，并分组提取蛋白，电泳、转膜、一抗(Survivin、Bcl-2、MMP-9均按1∶500稀释)4 ℃过夜、TBST清洗5次，二抗(辣根过氧化物酶HRP标记)37 ℃孵育2 h, 后按Western blot 步骤测化学发光显影，凝胶成像，通过扫描仪采集条带，计算灰度值，独立重复实验3次。

1.6统计 采用SPSS 22.0统计软件进行分析，多组比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1沉默B-CPAP中Galectin-3后，B-CPAP中Galectin-3表达水平 通过Western blot检测后Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2均可以降低细胞中Galectin-3表达，其中以Galectin-3-siRNA1的效果稍佳，实验组及阴性对照组对Galectin-3蛋白表达无影响，见图1。

图1 Western blot检测Galectin-3-siRNA后甲状腺癌细胞Galectin-3表达变化

2.2MTT测沉默B-CPAP中Galectin-3后各组细胞增殖情况 经siRNA Galectin-3后，与空白组及NC-siRNA相比，Galectin-3-siRNA1、Galectin-3-siRNA2这两组细胞增殖率显著降低，差异有统计学意义(P<0.05),见图2。

图2 4组细胞增殖率比较

2.3Transwell小室测沉默B-CPAP中Galectin-3后各组细胞侵袭能力 结果如图3所示，与对照组及阴性组相比Galectin-3-siRNA1及Galectin-3-siRNA2组细胞侵袭能力显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 Galectin-3-siRNA对B-CPAP侵袭能力影响

2.4沉默B-CPAP中Galectin-3后对Bcl-2、Survivin及MMP-9蛋白表达影响 结果发现，沉默Galectin-3后凋亡抑制蛋白Bcl-2、Survivin表达明显降低，与空白对照组及阴性组相比差异显著，差异有统计学意义(P<0.05)，同时结果也显示MMP-9蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4、5。

图4 各组Survivin及Bcl-2蛋白表达

3 讨论

Galectin-3广泛分布肿瘤细胞内，参与细胞免疫调节及肿瘤增殖、侵袭等过程[5，7]。国内研究[8-9]发现，Galectin-3在多种肿瘤细胞中表达较为显著且在肿瘤细胞发展、转移过程中充当了重要的角色。有研究[10]显示，Galectin-3通过半乳糖苷结合功能调节细胞生长，与乳头状甲状腺癌的发生和转移有关。Shetty等[11]证实，使用RNA干扰Galectin-3表达后乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力均下降，使得癌细胞凋亡增加。有研究[12]发现减少Galectin-3可以抑制卵巢癌增殖、迁移和侵袭，过度表达Galectin-3则产生相反作用，该研究提示Galectin-3可能成为癌症治疗的新靶点。鉴于Galectin-3在肿瘤发生和癌症进展中的作用，其可作为甲状腺癌治疗潜在的靶点[5、13]。本研究通过探究沉默Galectin-3对B-CPAP的增殖、侵袭能力的影响，结果显示在B-CPAP中使用siRNA干扰Galectin-3表达后，B-CPAP增殖、侵袭能力明显下降(P<0.05)，差异有统计学意义，证实通过有效降低Galectin-3表达可以遏制B-CPAP增殖、侵袭能力，与研究结果相一致[11-12]。其也提示Galectin-3可作为甲状腺癌治疗潜在的靶点。

图5 各组MMP-9蛋白表达

Survivin属于凋亡抑制蛋白，能够维持细胞活性，抑制细胞凋亡,在肿瘤细胞的发生、发展过程中发挥重要的作用[14]。Survivin在甲状腺癌组织和细胞中均呈高表达，提示Survivin在甲状腺癌细胞的凋亡过程中发挥着重要作用，沉默Survivin表达可通过下调Bcl-2蛋白的表达引起甲状腺癌细胞凋亡[15]。Bcl-2是Bcl家族中最先发现的抑制细胞凋亡因子，主要通过细胞途径维持细胞正常增长，遏制细胞凋亡[16]。有研究发现通过抑制Bcl-2降低肿瘤细胞迁移而诱导细胞凋亡[17]。国外研究也发现Galectin-3与Bcl-2有相似的重要序列，且序列的存在与抗细胞凋亡的特征具有很大的相关性[5]。蛋白质-细胞内Galectin-3与Bcl-2蛋白的相互作用可能是Galectin-3抑制癌细胞凋亡的机制之一[18-19]。刘松[20]在甲状腺癌组织研究中发现Galectin-3基因与Survivin表达呈正相关，提示两者可能存在协同，但该实验仅从组织学上推测两者可能存在相关性，并未从细胞学上进一步来干预Galectin-3基因表达后探究Survivin蛋白表达的变化。本实验通过siRNA基因抑制Galectin-3表达后，Survivin、Bcl-2表达显著低于空白对照组及阴性对照组(P<0.05)，差异有统计学意义，即B-CPAP增殖、侵袭能力下降，从而表明Galectin-3在Survivin和Bcl-2使B-CPAP凋亡中的作用是促进的关系，也可能是沉默Galectin-3对B-CPAP增殖和侵袭能力的机制之一。

MMP-9属于MMP家族，为高度保守的蛋白水解酶，其在癌细胞的转移潜能中起着重要作用，可以破坏组织屏障细胞外基质，导致肿瘤发生转移[21]。大量证据表明[22]MMP-9是肿瘤生长、侵袭和转移的重要调节因子，此研究也发现高危甲状腺乳头状癌患者术前MMP-9水平较高，而那些需要重复剂量的131I治疗的患者MMP-9水平较高,故对转移性及碘难治性分化型甲状腺癌有指导意义。研究[23]证实MMP-9能促进转移生长因子诱导甲状腺癌的上皮-间质转化过程，MMP-9的高表达可能是影响甲状腺癌高侵袭性和预后不良的因素之一。有研究报道通过沉默MMP-9高转移性乳腺癌的侵袭和转移能力明显下降，这说明MMP-9过表达可以促进肿瘤细胞的远处转移[24]，以上研究均说明MMP-9在多种肿瘤细胞的增殖和侵袭能力过程中发挥重要的作用。杨柳等[25]研究发现在肺癌H460细胞中下调Galectin-3后的H460细胞中MMP-9水平下降，说明下调Galectin-3可能通过抑制肺癌细胞合成MMP-9发挥抗肿瘤作用。有研究表明MMP-9在甲状腺癌的侵袭和转移过程中起着重要的作用[26]。方政等[9]通过沉默Galectin-3表达发现口腔鳞状细胞MMP-9表达低于空白对照组。对于在B-CPAP中，研究沉默Galectin-3表达与MMP-9表达的相关性尚未见文献报道。本实验通过沉默Galectin-3表达进一步研究MMP-9蛋白表达的变化，MMP-9蛋白表达显著低于空白对照组及阴性对照组(P<0.05)，差异有统计学意义，同时B-CPAP增殖及侵袭能力也显著减弱。与之前实验相比，从细胞学角度证实可以通过沉默Galectin-3降低MMP-9蛋白表达，从而降低B-CPAP的增殖及侵袭能力。

既往对于Galectin-3与B-CPAP的增殖及侵袭能力的关系研究较少，现有报道仅是限于从甲状腺癌组织学角度的研究，从细胞学角度对于B-CPAP发生、发展的机制研究鲜有报道。本研究表明，借助于siRNA技术沉默Galectin-3基因表达，可以下调survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表达，B-CPAP增殖率明显下降，同时细胞侵袭能力也明显降低，Galectin-3在B-CPAP的发生发展中发挥了重要作用。沉默Galectin-3对B-CPAP增殖和侵袭能力的可能机制是沉默Galectin-3基因，下调了survivin、Bcl-2及MMP-9蛋白表达。本次研究结果也为该疾病，尤其是部分进展期、转移性病灶或碘难治性分化型甲状腺癌的未来靶向治疗提供可能理论依据。但本研究仍然存在不足之处，仅对沉默Galectin-3基因与survivin、Bcl-2及MMP-9下调的关系进行了简单的研究，而对于促进肿瘤细胞凋亡方面存在的具体机制尚需进一步深入研究。