铁皮石斛多糖减轻高糖诱导的HK-2细胞损伤研究*

韩秀平，谭 娟，贺钰梅△

（延安大学附属医院 1.全科医学科；2.中医内科,延安 716000）

糖尿病肾病是糖尿病最普遍、最严重的并发症之一。临床上，糖尿病肾病以蛋白尿、肌酐水平高和不规则的肾小球滤过率为特点，最终将引发慢性肾功能衰竭[1]。目前，糖尿病肾病仍缺乏治愈方法。因此，有必要发展新的治疗策略来缓解糖尿病肾病的发生发展。氧化应激是糖尿病发病机制的主要独立参与因素[2]，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）是评估氧化应激的重要生理参数。SOD 催化超氧化物转化为氧气和过氧化氢，是重要的抗氧化标志物，机体MDA 水平越高，氧化应激反应越严重[3]。铁皮石斛多糖是从我国传统药材铁皮石斛茎中分离出来的主要活性成分，常用于治疗肝炎、糖尿病、肥胖症和类风湿性关节炎[4]。研究表明，铁皮石斛多糖对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠具有显著降血糖作用[5]，可缓解糖尿病大鼠氧化应激、炎症和肝脏脂质积聚等症状[6]。然而，铁皮石斛多糖是否抗糖尿病肾病仍不清楚。微小RNA（MicroRNA，miRNA/miR）是小的非编码RNA分子，通过与编码蛋白质的mRNA 的3'非翻译区结合来调节多种生物学过程。先前的实验已经暗示，包括miRNA在内的非编码RNA分子是调节高血糖症的重要生物标志物，并且它们与糖尿病性肾病有关[7]。根据最近的报道，miR-363 在糖尿病肾病中低表达[8]，白藜芦醇可能通过上调miRNA mmu-miR-363-3p来改善高脂饮食诱导的小鼠肝胰岛素抵抗[9]。因此，miR-363可以用作糖尿病的候选生物标志物或潜在治疗靶点。然而，miR-363 在铁皮石斛多糖介导的糖尿病肾病中的作用尚未见到深入研究的报道。为此，本实验利用高糖诱导人肾小管上皮细胞HK-2 损伤，观察铁皮石斛多糖的保护作用，并结合miR-363，从细胞活性、凋亡和氧化应激方面探讨铁皮石斛多糖的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞HK-2（美国ATCC）；铁皮石斛多糖（SD9310，北京Solarbio）；miR-363 模拟物、miR-363抑制剂anti-miR-363、模拟物阴性对照miR-NC（上海GenePharma）；细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）（CK-04，日本Dojindo）；B 细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）抗体（ab692，美国Abcam）；Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）抗体（ab77566，美国Abcam）；膜联蛋白V（AnnexinV）-FITC/碘化丙锭（Propidium Iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒（C1062L，上海碧云天）；SOD 检测试剂盒（S0109，上海碧云天）；MDA检测试剂盒（S0131S，上海碧云天）；PrimeScript RT试剂盒（RR047A，北京Takara）；Lipofectamine 2000 试剂（11668-019，美国Invitrogen）。

1.2 细胞培养

HK-2细胞在达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）中培养，其中包含10%胎牛血清，生长的培养箱温度为37 ℃，含5%CO2。

1.3 实验分组

将HK-2 细胞分为NG 组（正常糖，5 mmol/L 葡萄糖）、HG 组（高糖，30 mmol/L 葡萄糖[10]）、HG+铁皮石斛多糖-L、M、H 组（30 mmol/L 葡萄糖+100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 铁皮石斛多糖[11]）、HG+miR-NC组（30 mmol/L葡萄糖+转染miR-NC）、HG+miR-363 组（30 mmol/L 葡萄糖+转染miR-363 模拟物）、HG+铁皮石斛多糖组（30 mmol/L 葡萄糖+400 μg/mL 铁皮石斛多糖）、HG+铁皮石斛多糖+anti-miR-363 组（30 mmol/L 葡萄糖+转染anti-miR-363+400 μg/mL 铁皮石斛多糖）。HK-2 细胞转染时，根据Lipofectamine 2000 试剂操作说明进行，转染6 h 后，以高糖或铁皮石斛多糖处理，高糖、铁皮石斛多糖作用时间为48 h。

1.4 CCK-8法测定细胞存活率

各组HK-2细胞（1×104个/孔）接种于96孔板，在DMEM中培养48 h。将10 μL CCK-8溶液与每孔细胞反应2 h。通过酶标仪测量450 nm波长处的细胞光密度（OD）值。存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.5 流式细胞术测定细胞凋亡率

将各组HK-2 细胞用PBS 洗涤，在结合缓冲液中重悬。将1×106个HK-2细胞分别与5µL Annexin V-FITC、5µL PI避光反应，细胞染色后在BD Biosciences流式细胞仪上测量HK-2细胞的凋亡率。

1.6 Western blotting测定Bax、Bcl-2蛋白表达量

HK-2 细胞经不同处理后，在RIPA 裂解液中进行蛋白的抽提。将30 μg 变性蛋白进行10% SDSPAGE、转膜。膜在5%无脂牛奶中封闭后，在4 ℃下用Bax、Bcl-2 和对照GAPDH 一抗（均为1∶1 000 稀释）孵育12 h。随后室温下用HRP偶联的山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000 稀释）处理1 h。使用增强型化学发光分析系统对膜进行处理，最后将其暴露于X射线胶片，通过扫描OD法评估Bax、Bcl-2蛋白的表达量。

1.7 试剂盒测定氧化应激指标

收集不同处理的HK-2细胞上清液，按照SOD、MDA 检测试剂盒的操作说明，进行SOD 活性、MDA含量测定。

1.8 定量Real-time PCR测定miR-363的表达

HK-2 细胞使用TRIzol 提取总RNA，并使用上海奥析UV1901 紫外分光光度计检测RNA 的浓度和纯度。使用PrimeScript RT 试剂盒通过逆转录将RNA 反转录为cDNA（50 ng/μL），并保存在-80 ℃冰箱。根据两步法，使用ABI 7900HT 实时PCR 系统进行PCR。U6用作miR-363的内参，相对表达使用2-ΔΔCt方法确定。

miR-363 引物，上游：5'-CCAATTGCACGGTATCCAT-3'，下游：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6引物，上游：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.9 统计学方法

将每个实验3 次重复的数据在SPSS 22.0 软件中进行整理分析，计量资料以均数±标准差（）表示。组间比较采用单因素方差分析和t检验，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2细胞活性和凋亡的影响

高糖诱导的HK-2细胞后，与NG组相比，HG组细胞存活率降低，凋亡率、Bax蛋白水平增加，Bcl-2蛋白水平降低（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+铁皮石斛多糖-L组、HG+铁皮石斛多糖-M组、HG+铁皮石斛多糖-H组细胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平减少，Bcl-2蛋白水平升高（P＜0.05），且均呈浓度依赖性（表1，图1）。

图1 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2细胞活性和凋亡的影响

表1 铁皮石斛多糖抑制高糖诱导的HK-2凋亡，n=3

表1 铁皮石斛多糖抑制高糖诱导的HK-2凋亡，n=3

与NG 组相比，aP＜0.05；与HG 组相比，bP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-L 组相比，cP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-M组相比，dP＜0.05。

2.2 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2氧化应激的影响

与NG 组相比，HG 组HK-2 细胞的SOD 活性降低，MDA 含量升高（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+铁皮石斛多糖-L组、HG+铁皮石斛多糖-M组、HG+铁皮石斛多糖-H 组HK-2 细胞的SOD 活性逐渐增加，MDA含量逐渐减少（P＜0.05），且均呈浓度依赖性（表2）。

表2 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2 中SOD 和MDA 表达的影响，n=3

表2 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2 中SOD 和MDA 表达的影响，n=3

与NG 组相比，aP＜0.05；与HG 组相比，bP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-L 组相比，cP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-M组相比，dP＜0.05。

2.3 铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2 中miR-363表达的影响

与NG 组相比，HG 组HK-2 细胞的miR-363 表达降低（P＜0.05）；与HG 组相比，HG+铁皮石斛多糖-L组、HG+铁皮石斛多糖-M组、HG+铁皮石斛多糖-H 组HK-2 细胞的miR-363 表达逐渐增加（P＜0.05），且呈浓度依赖性（表3）。

表3 铁皮石斛多糖促进高糖诱导的HK-2中miR-363的表达，n=3

表3 铁皮石斛多糖促进高糖诱导的HK-2中miR-363的表达，n=3

与NG 组相比，aP＜0.05；与HG 组相比，bP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-L 组相比，cP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖-M组相比，dP＜0.05。

2.4 过表达miR-363对高糖诱导的HK-2细胞凋亡及氧化应激的影响

在HK-2 细胞中过表达miR-363 后，HG+miR-363组miR-363表达、细胞存活率比HG+miR-NC组高，凋亡率、Bax蛋白水平比HG+miR-NC组低，Bcl-2蛋白水平、SOD活性比HG+miR-NC组高，MDA含量比HG+miR-NC组低（P＜0.05）（表4，图2）。

图2 过表达miR-363对高糖诱导的HK-2凋亡的影响

表4 过表达miR-363对高糖诱导的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响，n=3

表4 过表达miR-363对高糖诱导的HK-2细胞活性、凋亡及氧化应激的影响，n=3

与HG+miR-NC组相比，aP＜0.05。

2.5 抑制miR-363 对铁皮石斛多糖作用的高糖诱导的HK-2凋亡及氧化应激的影响

与HG组相比，HG+铁皮石斛多糖组、HG+铁皮石斛多糖+anti-miR-363 组miR-363 表达水平、细胞存活率增加，凋亡率、Bax蛋白水平减少，Bcl-2蛋白水平、SOD 活性升高，MDA 含量降低（P＜0.05）；并且HG+铁皮石斛多糖+anti-miR-363 组miR-363 表达水平、细胞存活率低于HG+铁皮石斛多糖组，凋亡率、Bax蛋白水平高于HG+铁皮石斛多糖组，Bcl-2 蛋白水平、SOD 活性低于HG+铁皮石斛多糖组，MDA含量高于HG+铁皮石斛多糖组（表5，图3）。

表5 抑制miR-363可逆转铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2凋亡及氧化应激的作用，n=3

表5 抑制miR-363可逆转铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2凋亡及氧化应激的作用，n=3

与HG组相比，aP＜0.05；与HG+铁皮石斛多糖组相比，bP＜0.05。

图3 抑制miR-363可逆转铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2凋亡的影响

3 讨论

肾小管细胞是糖尿病肾病的主要靶点，它在糖尿病肾病病理进展中发挥重要作用[12]。早期糖尿病肾病出现肾小管上皮细胞的凋亡及氧化损伤现象[13]。因此，找到可以靶向肾小管上皮细胞凋亡及氧化损伤的有效药物，将有助于阻断糖尿病肾病进程。本研究分析了铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2细胞存活率、凋亡和氧化应激过程的影响，发现铁皮石斛多糖可以保护高糖诱导的HK-2 细胞损伤，其可能成为糖尿病肾病的潜在治疗药物。并且，其机制与miR-363密切相关。

肾小管上皮细胞凋亡是糖尿病肾病的重要特征[14]。Bcl-2 家族是线粒体凋亡途径的主要调节因子，影响一系列参与调节细胞凋亡的下游基因，包括促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2[15]。资料显示，铁皮石斛多糖可以增强高糖处理的人角膜上皮细胞活性、Bcl-2 水平，减弱其凋亡、Bax 水平[11]。铁皮石斛多糖对高糖诱导的血管内皮细胞生长、Bcl-2表达具有促进作用，对Bax 表达具有抑制作用[16]。本研究中，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 铁皮石斛多糖促进高糖诱导后HK-2 细胞的存活率、Bcl-2水平，并抑制高糖引起的HK-2 细胞凋亡率、Bax 水平增加，说明在高糖诱导后HK-2细胞中，铁皮石斛多糖可以增加细胞活性，减轻细胞凋亡，与前述研究相似。

氧化应激被认为是糖尿病肾病发病机理和进展的关键因素[17]。肾小管上皮细胞中氧化应激水平升高与高糖环境有关，这可能导致肾功能障碍[18]。脂质过氧化物的产物MDA水平升高可以用作氧化应激的标志，细胞内SOD活性降低表明体内抗氧化能力降低[19]。铁皮石斛多糖被报道可以增强2型糖尿病小鼠的抗氧化活性，提高SOD和过氧化氢酶活力[20]。在肾阴虚大鼠中，铁皮石斛多糖通过提高SOD 活性，降低MDA 含量改善大鼠的抗氧化能力[21]。本研究中，高糖处理使HK-2 细胞抗氧化酶SOD 的活性降低，MDA 含量增加，导致HK-2 细胞的氧化应激，与前人的研究[19]相符合。而不同浓度铁皮石斛多糖的治疗增加了高糖诱导后HK-2细胞的SOD活性，并减少MDA含量，可见铁皮石斛多糖能够减轻高糖所致的HK-2 细胞氧化应激。因此，铁皮石斛多糖通过调节细胞活性、凋亡和氧化应激水平，对高糖诱导的HK-2细胞产生保护作用。

miR-363在2型糖尿病中发挥作用，是糖尿病风险的预后生物标志物[22]，但其在糖尿病肾病中的详细功能仍然未知。研究表明，在转化生长因子β1处理的HK-2 细胞中，miR-363-3p 的水平显著降低，miR-363-3p对体外肾纤维化起保护作用[23]。在链脲佐菌素诱导的2 型糖尿病大鼠中，大鼠膀胱逼尿肌组织中miR-363 的表达降低，上调miR-363 导致大鼠逼尿肌细胞中Bcl-2表达增加，加速细胞存活，同时降低细胞凋亡和Bax 的表达，从而改善2 型糖尿病大鼠的逼尿肌纤维化[24]。本研究中，高糖降低HK-2 细胞中miR-363 表达，这与彭睿等[8]观察到的miR-363在糖尿病肾病表达下调一致，提示miR-363与糖尿病肾病进展有关。本研究还检测到与前述报告[23-24]类似的结果，即过表达miR-363使高糖诱导的HK-2 细胞的存活率、Bcl-2 水平增加，凋亡率、Bax 水平减少。同时，过表达miR-363 还增加了高糖诱导的HK-2 细胞SOD 活性，减少MDA 含量，表现出其抗氧化能力。另外，不同浓度铁皮石斛多糖促进高糖诱导的HK-2细胞的miR-363表达，并且铁皮石斛多糖对高糖诱导的HK-2 细胞活性、凋亡及氧化应激的影响被抑制miR-363所逆转。说明铁皮石斛多糖保护高糖诱导的HK-2细胞损伤的功能是通过促进miR-363表达来实现的。

总之，本研究发现铁皮石斛多糖对糖尿病肾病产生潜在的保护作用，能增强高糖诱导的HK-2 细胞活性，减弱细胞凋亡，并改善氧化应激，机制与上调miR-363表达有关。这为铁皮石斛多糖治疗糖尿病的机制提供了新的见解。