S100A6对黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响及机制研究*

刘 硕，常 谨，刘英琦

（1.河北邯郸市第一医院颌面外科，邯郸 056002；2.河北工程大学附属医院整形外科，邯郸 056000）

黑色素瘤是由黑色素细胞发生恶性转化而形成的。恶性黑色素瘤具有极强的侵袭力，易出现转移，治愈率及预后极差[1]。因此，寻找有效的治疗黑色素瘤方法是目前的热点及难点。PI3K/Akt 信号通路是经典的调控细胞增殖和凋亡的通路[2]，可以通过调控多种细胞因子的表达而抑制细胞凋亡，诱导肿瘤细胞增殖分化。PI3K/Akt 信号通路与肿瘤细胞的血管形成、化疗药物耐药、放疗抵抗密切相关[3]。黑色素瘤的发病机制、治疗与PI3K/Akt 信号通路息息相关[4-5]，有研究显示，Notch1 调控PI3K/Akt信号通路促进黑色素瘤细胞生长[6]。S100A6属于S100蛋白家族成员，它能与游离的钙离子结合而发挥生物学作用，可以参与细胞的增殖、凋亡等多个生物学过程。已有研究表明，增加S100A6 表达可通过上调PI3K/Akt信号通路中Akt的磷酸化促进人骨肉瘤细胞143B 增殖和迁移，添加PI3K 抑制剂（LY294002 或wortmannin）在一定程度上逆转了S100A6 对143B 细胞中Akt 磷酸化的上调作用，同时，也逆转了S100A6 表达对143B 细胞的影响[7]。但是，S100A6对黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移的明确作用还尚未见相关报道。因此，探讨S100A6 对黑色素瘤细胞A375增殖、侵袭和迁移的影响，并初步分析其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人黑色素瘤细胞（A375 系）（货号：CL-0014）购买于武汉普诺赛生命科技有限公司。胎牛血清、胰蛋白酶溶液（含酚红，含0.25%EDTA）、RPMI 1640培养基（ATCC Modification）、DMEM 高糖培养基、opti-MEM 等，购自美国Gibco 公司；转染试剂Lipofectamine3000 购自美国Thermo 公司；兔抗c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、PI3K、p-PI3K、GSK3β、AKT、p-AKT 多克隆抗体购自美国Abcam 公司；鼠抗人GAPDH 抗体购自北京全式金有限公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体购自美国CST；PI3K 抑制剂（LY294002）购自美国Sigma 公司；化学发光试剂盒购自美国Thermo Fisher 公司；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒购自Takara；Platinum SYBR Green PCR试剂盒购自北京全式金有限公司；PVDF膜自Millipore；Transwell 小室购自Corning 公司；Matrigel基质胶购自美国BD Bioscience公司。

1.2 细胞培养

取出冻存管，进行细胞复苏，细胞贴壁后，从培养箱取出细胞瓶进行换液，向培养瓶中加入适量的10%FBS DMEM 培养基置于CO2培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养。一般隔两天换液1 次，待细胞长满瓶壁85%左右进行细胞传代。

1.3 细胞分组及S100A6过表达载体的构建

从GeneBank 中寻找S100A6 基因的编码区（CDS）碱基序列（NM-014624.3），设计基因CDS 全长引物，PCR扩增，经BamH I和EcoR I酶切后，插入pcDNA3.0 真核表达载体，经酶切、PCR 和测序鉴定，构建pcDNA3.0-S100A6 真核表达载体。将A375细胞接种于6孔板分4组：空白对照组、空载体对照组、S100A6 转染组、S100A6 转染+抑制剂组。空白对照组正常培养基培养24 h；空载体对照组使用脂质体法转染S100A6 过表达空载质粒pcDNA3.0，后使用正常培养基培养24 h；S100A6 转染组使用脂质体法转染S100A6 过表达载体pcDNA3.0-S100A6，后使用正常培养基培养24 h；S100A6 转染+抑制剂组使用脂质体法转染pcDNA3.0-S100A6 使用含PI3K 抑制剂LY294002 的培养基培养24 h。选取各组处理的对数期生长的细胞进行后续实验研究。

1.4 RT-qPCR检测S100A6 mRNA表达水平

细胞经过培养或处理后，PBS 洗一遍，加入Trizol 试剂进行细胞总RNA 提取，然后通过两步法转录为cDNA，采用SYBR Green 进行荧光定量PCR，以GAPDH 为内参基因，每个样本做3 个重复孔。GAPDH 的上游引物序列5'-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3'，下游引物序列5'-TCTGCTGTCTTTGGGACCTTGTC-3'；S100A6 的上游引物序列5'-ATGGCATGCCCCTGGATCAGG-3'，下游引物序列5'-TCAGCCCTTGAGGGCTTCAT-3'。RT-qPCR扩增体系为10 μL，反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，进72 ℃延伸40 s 行35个循环。实验重复3次，使用2-ΔΔct法计算S100A6 mRNA的相对表达水平。

1.5 MTT法检测细胞增殖能力

取对数生长期的细胞，细胞计数接种于96孔板中，每孔100 μL，在培养24 h、48 h、72 h时，加入10 μL的MTT溶液，37 ℃继续培养4 h。弃去孔内培养基，每孔加入150 μL DMSO 震荡混匀，用酶标仪检测492 nm 的OD 值。细胞存活率=实验组OD 值/对照组OD值×100%。重复上述实验3次。

1.6 划痕愈合实验测定细胞迁移率

取传代一致的细胞，调整细胞浓度至l×106cell/mL 接种于6 孔板，采用10 μL 的微量加样枪头画出无细胞区，显微镜下观察并记0 h 划痕宽度。继续培养细胞24 h 后在同一位置观察拍照记录划痕宽度，每组取3处计算其平均值。迁移率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。

1.7 Transwell检测细胞侵袭能力

按方法“1.3项”进行分组转染，并将BD基质胶置于4 ℃冰箱以使其处于完全融化状态。将Tranawell 小室放置24 孔板中，取60 μL Matrigel 铺于小室滤膜上，37 ℃培养箱中凝胶1 h，吸取上室多余液体加入200 μL无FBS的DMEM，37 ℃培养箱1 h水化基底膜以备用。在24孔板下室中加入500 μL含10% FBS 的DMEM 高糖培养液，基质胶包被Tranawell 小室中加入100 μL各组细胞悬液（细胞总数约2×105个）；48 h后弃去24孔板下室中的培养基，在下室中加入600 μL 甲醇固定20 min，弃去甲醇加入600 μL 0.1%结晶紫溶液染色15 min，使用棉签擦去上室细胞，室温下干燥，最后在显微镜下观察，每孔随机选取3个视野拍照，记录每个视野的穿膜细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.8 Western blotting检测PI3K/Akt信号通路及增值、侵袭相关蛋白

细胞经过培养和处理后24 h 进行蛋白收取，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，蛋白变性，调整蛋白浓度进行电泳，空白孔用1×Loading buffer 补齐，电泳结束后，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗分别用PI3K、p-PI3K、GSK3β、Akt、p-Akt、c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 抗体以1∶500 进行4 ℃过夜孵育，二抗分别用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶5 000）和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（1∶5 000）抗体室温孵育2 h，ECL显影，用凝胶成像仪获取图像，并对图像进行灰度分析（Image Lab 软件）。

1.9 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，组与组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定过表达S100A6 黑色素瘤细胞系A375 构建

与空白对照组相比，空载体对照组中S100A6 mRNA 水平不变（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6 转染组中S100A6 mRNA 水平显著升高（P＜0.05）；与S100A6 转染组相比，S100A6转染+抑制剂组中S100A6 mRNA水平不变（P＞0.05），见图1。

图1 RT-qPCR法检测各组细胞中S100A6 mRNA相对表达水平

2.2 过表达S100A6对细胞增殖影响

与空白对照组相比，空载体对照组细胞增殖抑制率无明显差异（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6 转染组细胞存活率显著升高（P＜0.05）；与S100A6转染组相比，S100A6转染+抑制剂组细胞存活率下降（（P＜0.05），见图2。

图2 MTT法检测各组细胞存活率情况

2.3 过表达S100A6对细胞侵袭影响

与空白对照组相比，空载体对照组细胞侵袭个数无显著差异（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6 转染组细胞侵袭个数显著升高（P＜0.05）；与S100A6转染组相比，S100A6转染+抑制剂组细胞侵袭个数显著下降（P＜0.05），见图3。

图3 各组细胞侵袭情况分析

2.4 过表达S100A6对细胞迁移影响

与空白对照组相比，空载体对照组细胞迁移率无显著差异（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6 转染组细胞迁移率显著升高（P＜0.05）；与S100A6转染组相比，S100A6转染+抑制剂组细胞迁移率显著下降（P＜0.05），见图4。

图4 各组细胞迁移情况分析

2.5 过表达S100A6对PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达影响

与空白对照组相比，空载体对照组p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β 蛋白浓度无显著差异（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6 转染组细胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β 蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与S100A6 转染组相比，S100A6 转染+抑制剂组细胞p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K、GSK3β显著降低（（P＜0.05），见图5。

图5 各组细胞PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达情况分析

2.6 过表达S100A6 对细胞增殖、侵袭相关蛋白表达影响

与空白对照组相比，空载体对照组c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白浓度没有显著变化（P＞0.05）；与空白对照组、空载体对照组比较，S100A6转染组细胞c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与S100A6转染组相比，S100A6 转染+抑制剂组c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 细胞蛋白表达显著降低（P＜0.05），见图6。

图6 各组细胞增殖、侵袭相关蛋白表达情况分析

3 讨论

恶性黑色素瘤可从原发病灶转移，从而形成继发性的肿瘤组织，不能有效通过手术治疗，预后效果极差，长期生存率小于10%[8]。因此，黑色素瘤的治疗难度高，寻找高效的药物和治疗手段成为研究热点。

S100A6 最初由Kuznicki 等[9]在Ehrlich 腹水瘤中检出，属于S100 钙离子结合蛋白家族，当它结合钙离子后随即发生蛋白构象改变，使其经典的EF手型结构得以暴露，该EF手型结构可以与多种靶蛋白结合。研究发现，S100A6在结直肠癌组织和细胞系中高表达，并促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭，与患者的不良预后密切相关[10]。S100A6 蛋白通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭，诱导细胞凋亡，进而抑制Calu-6 肺癌细胞生长[11]。S100A6 表达与患者的年龄及肿瘤分化有密切的关系，并且可以根据S100A6 基因的表达来判断肺鳞状细胞癌预后的效果[12]。S100A6 通过促进细胞增殖和抑制成骨细胞分化来加速人类骨肉瘤的生长[13]。但是S100A6 在黑色毒瘤细胞中的分子机制尚不清楚。因此，探讨S100A6在黑色毒瘤细胞增殖、侵袭、迁移的影响，有望为该病的诊断及治疗提供潜在的标志物和靶标。c-Myc 与CyclinD1 属于细胞增殖相关蛋白，二者蛋白水平可在一定程度上反映细胞的增殖能力[14]；MMP-2 和MMP-9 属于MMPs 家族，是一种高度保守的锌离子依赖性蛋白水解酶，可通过降解上皮基底膜或细胞外基质，促进癌细胞的侵袭和迁移[15]。本研究通过过表达S100A6，发现S100A6 过表达显著促进了黑色素瘤细胞增殖活力、侵袭细胞数和迁移细胞数；c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9增殖、侵袭蛋白表达水平也显著升高，与以上实验的研究结果一致。表明S100A6过表达可能通过上调c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白水平促进黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

PI3K/Akt 通路在肿瘤的发生发展中起重要作用，PI3K 是一种脂质激酶，可传播细胞内信号级联并调节多种细胞过程，Akt是PI3K信号传导的重要下游效应器，参与调控细胞增殖、凋亡、代谢等在内的多种途径。GSK3β 是PI3K/Akt 信号通路的关键下游底物和效应物，Akt 可以通过磷酸化GSK3β 而抑制其活化[16]。Li等[17]研究发现，S100A6对肝癌细胞增殖、迁移的促进效应依赖于PI3K/Akt信号通路的激活。Ke 等[18]发现，c-Src 可以通过PI3K/Akt 通路诱导EMT，从而促进鼻咽癌的转移。肾上腺素通过PI3K/Akt信号通路的失活抑制黑色素瘤A375细胞的生长和转移[19]。有研究表明，S100A6可以通过PI3K/Akt 信号通路促进宫颈癌细胞的增殖和迁移[20]。因此，我们推测PI3K/Akt 通路可能也参与介导S100A6 促黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移的效应。本研究结果显示，在黑色素瘤细胞中，转染pcDNA3.0-S100A6 质粒后p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、GSK3β显著增加，表明它可以激活PI3K/Akt信号通路。但是当加了PI3K/Akt 信号通路的抑制剂时出现了逆转的现象，说明S100A6可能通过激活PI3K/Akt 信号通路进而影响c-Myc、CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达，从而调控黑色素瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。

综上所述，S100A6 可促进黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移，其促进黑色素瘤细胞增殖、侵袭、迁移作用机制可能是通过激活PI3K/Akt 信号通路来实现的。但是，此次试验并没有对其它通路进行排除，并未通过下调S100A6表达进行反向验证，且并未在动物模型体内验证本研究结论，故存在一定的局限性，还需要进一步进行实验分析。