水媒法燕麦分离蛋白的制备

王妙玲,张彩猛,李兴飞,华欲飞

(江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122)

燕麦是禾本科燕麦属一年生草本植物,依种子带壳与否分为皮燕麦和裸燕麦两大类型。我国以种植裸燕麦为主。其富含β-葡聚糖、不饱和脂肪酸、酚酸、维生素等功能性成分[1],具有预防心血管疾病、降低胆固醇和平稳血糖等功效,因此受到人们的关注[2-3]。

燕麦中的蛋白质含量较高,在11.35%～19.9%,在谷物中居于首位[4]；燕麦中的蛋白质按其溶解性的不同,可分成4种蛋白质,分别为清蛋白(10%～20%)、球蛋白(12%～55%)、谷蛋白(23%～54%)和醇溶蛋白(12%～14%)[5]；燕麦蛋白的氨基酸构成比较平衡,各种必需氨基酸的含量接近联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO)/世界卫生组织(World Health Organization，WHO)推荐值[6-7],蛋白质功效比超过2.0,生物价为72～75[8]。与大多数其他谷物不同,燕麦蛋白质的麸质(gluten)成分较少,因此其可以供乳糜泻患者安全食用[9]。

在以往制备燕麦蛋白的工艺研究中[10-12],国内外研究者们为提高燕麦蛋白的含量,会引入有机溶剂进行脱脂或使用酶制剂,这些方法显然不符合绿色生产的标准,会使燕麦蛋白的使用范围大大受限,不能应用到食品工业中去。

本研究的主要目的是在不使用溶剂浸出,而且蛋白质不被酶解的情况下制备蛋白质含量大于90%的燕麦蛋白产品,提高蛋白质含量的过程实际上就是去除燕麦中其他成分的过程。相对来说,燕麦中的碳水化合物类成分,包括淀粉、纤维、β-葡聚糖等[13-14],较容易与蛋白质实现分离,而脂质成分与蛋白质之间有较强作用力,不容易分离[15]。作者经过大量研究,提出了燕麦打浆、冷冻、分级沉淀的工艺路线,可以同时制备燕麦分离蛋白(oat protein isolate,OPI)和燕麦浓缩蛋白(oat protein concentrate,OPC)。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

裸燕麦,沈阳信昌粮食贸易有限公司；氢氧化钠、硫酸、盐酸、硫酸铜、葡萄糖、无水硫酸钠、石油醚、三氯甲烷、甲醇、无水乙醇、酒石酸钾钠、亚铁氰化钾、亚甲蓝、甲基红等,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

HimacCR21G Ⅱ型冷冻离心机,日本Hitachi公司；BLST4090B-073打浆机,东莞汇勋电器制品有限公司；K9840半自动凯氏定氮仪,济南海能仪器股份有限公司；UV2450型紫外分光光度计,日本岛津公司；PHS-3C数显pH计,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；HH-S数显恒温水浴锅,江苏省金坛市医疗仪器厂；90型磁力搅拌器,上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 OPI与OPC制备的工艺路线

取一定质量的裸燕麦,按料水比1∶12(g∶mL)加入去离子水,25 ℃浸泡12 h,浸泡结束后8 000 r/min打浆2 min。打浆后的浆液即为燕麦糊,使用2 mol/L NaOH溶液调节燕麦糊pH 至8.5,搅拌提取1.0 h,放入-18 ℃冰箱冷冻10 h,常温水浴自然解冻,燕麦糊3 000×g离心15 min,弃去下层沉淀,收集上清液,上清液于50 ℃水浴加热30 min,加入1 mol/L HCl溶液调节上清液pH至7.2,6 000×g离心15 min,下层沉淀即为OPI,上清液用1 mol/L HCl溶液调节 pH 至5.2,3 000×g离心15 min得到OPC。

1.2.1.1 提取pH对OPI蛋白质含量的影响

取100 g裸燕麦,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打浆2 min(8 000 r/min)。取8份等质量的燕麦糊,使用2 mol/L NaOH溶液调节pH分别为6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0,提取温度25 ℃、提取时长1.0 h,3 000×g离心15 min,得到上清液,使用1 mol/L HCl溶液将上清液调节pH至7.2,6 000×g离心15 min,得到OPI,测其蛋白质含量。

1.2.1.2 离心分级pH对OPI蛋白质含量的影响

取100 g裸燕麦,浸泡12 h后,按料水比1∶12(g∶mL)打浆2 min(8 000 r/min)。使用2 mol/L NaOH溶液调节燕麦糊pH为8.5,3 000×g离心15 min,得到上清液,将上清液分成等质量的11份,使用1 mol/L HCl溶液将11份上清液分别调节pH为4.5、5.2、5.7、6.0、6.2、6.5、6.8、7.0、7.2、7.5、7.8,6 000×g离心15 min,温度25 ℃、提取时长0.5 h,6 000×g离心15 min,下层沉淀即为OPI,测其蛋白质含量。

1.2.1.3 冷冻时长对OPI蛋白质含量的影响

取一定质量的裸燕麦,按照1.2.1.1相同条件浸泡打浆,调节pH 8.5,搅拌提取后,将燕麦糊分为等质量的8份,放在-18 ℃冰箱中,分别冷冻0、3、5、7、9、10、13、21 h,在常温水浴自然解冻,3 000×g离心10 min,得到上清液,上清液50 ℃水浴加热30 min后,加入1 mol/L HCl溶液调节上清液 pH 至7.2,6 000×g离心15 min,下层沉淀即为OPI,测其蛋白质含量。

1.2.2 基本成分测定方法

蛋白质含量参照GB 5009.5 —2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法进行测定,燕麦蛋白质折算系数为5.83；脂肪含量参照氯仿甲醇法进行测定[16]；淀粉含量参照GB 5009.9—2016《食品安全国家标准 食品中淀粉的测定》进行测定；灰分含量参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》进行测定；水分含量参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》中直接干燥法进行测定。

蛋白质和脂肪提取率的计算如公式(1)所示：

蛋白质(脂肪)提取率/%=

(1)

1.2.3 氨基酸的测定

称取0.1 g蛋白样品于水解管中,加入8 mL 6 mol/L HCl溶液,充分混合均匀后向水解管中氮吹3 min,置于120 ℃烘箱内水解20 h。在室温下自然冷却后,转移至试管中,用4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和,定容至25 mL,混匀后用双层滤纸过滤。滤液7 000×g离心10 min,取上清液进行分析。采用OPA柱前衍生反相高效液相色谱紫外检测法进行氨基酸测定,用外标法定量,计算氨基酸评分(amino acid score,AAS)。

1.2.4 数据处理

实验均重复3次,采用Origin对数据进行分析和绘图,结果用“平均值 ± 标准偏差”表示,使用SPSS 软件对数据进行显著性分析(P<0.05表示具有显著性差异)。

2 结果与分析

2.1 OPI的制备

2.1.1 燕麦原料的基本成分

小麦、玉米、大麦等粮食类谷物中的蛋白质含量均在10%以下,由表1可知,裸燕麦中蛋白质含量为12.5%,相比之下,燕麦中的蛋白质含量在谷物中较高,因此从燕麦中提取蛋白质意义重大。

表1 燕麦原料的基本成分 单位：%

2.1.2 提取pH对OPI蛋白质含量的影响

将打浆后的燕麦糊调节至不同的pH提取蛋白质,结果表明在未加碱pH 6.5的条件下,蛋白质的提取率和含量均为最低,提高pH可明显提高蛋白质的提取率和含量,因此燕麦中的蛋白质在碱性条件下更易于溶出,在pH 8.5时,蛋白质含量达到最大,为78.58%,而且提取率也达到36.15%,虽然蛋白质的提取率随着pH的继续升高仍会增大,但是增幅较小,而且过碱的条件会使燕麦浆液具有刺鼻的碱味。以蛋白质含量为主要考察指标,选取最佳提取pH为8.5。

图1 提取pH对OPI蛋白质含量的影响Fig.1 The effect of extraction pH on OPI protein content

2.1.3 分级离心pH对OPI蛋白质含量的影响

将上清液的pH分别调节至4.5～7.8,进行离心沉淀,发现OPI的蛋白质含量呈现出先升高后降低的趋势,在pH 7.2时达到最大,为77.65%,远远高于在等电点pH 5.2时的蛋白质含量65.14%,表明燕麦中存在一部分蛋白质在中性条件下先进行沉淀,而且这一部分蛋白质结合杂质的量较少,所以燕麦蛋白的含量较高。因此,在进行等电点沉淀之前,可以在中性条件下先进行一次分级沉淀,得到蛋白质含量较高的OPI,剩余的上清液再进行等电点沉淀,回收剩余蛋白质,得到燕麦含量较低但提取率较高的OPC。

图2 分级离心pH对OPI蛋白质含量的影响Fig.2 The effect of pH in fractional centrifugation on OPI protein content

2.1.4 燕麦糊冷冻处理

图3为燕麦蛋白提取工艺流程图,本实验对蛋白质和脂质在各组分中的分配情况进行了测定,数据见表2。由表2数据可知,燕麦糊是否进行冷冻处理对OPI中蛋白质和脂质含量影响很大,未冷冻处理得到的OPI中脂质含量为15.53%,冷冻以后,OPI中蛋白质含量升高,脂质含量降低至6.92%,提取率降低至7.35%。未冷冻处理的a 上清液1和冷冻处理的b 上清液1中蛋白质和脂质的提取率几乎没有差异,将pH调至中性沉淀后,未冷冻和冷冻处理的上清液2和沉淀2(OPI)的蛋白质和脂质的分配情况出现了差异,a OPI中的脂质提取率为12.86%,而冷冻以后,b OPI中脂质提取率仅为7.35%,与此同时,a 上清液2中的脂质提取率为72.3%,冷冻以后,提取到b 上清液2中的脂质增加至77.68%。因此,原本倾向于沉降到OPI中的脂质经过冷冻处理后会转移至上清液2中,所以沉淀b OPI中的蛋白质含量得到提高。

a-未冷冻处理;b-冷冻处理图3 从燕麦糊中提取OPI的流程图Fig.3 Flow chart of extracting OPI from oat

表2 冷冻处理对各组分中蛋白质与脂质的影响 单位：%

孙旦[17]和朱敏敏等[18]均研究了冷冻对乳状液破乳的影响,并认为冷冻会形成冰晶刺穿包裹油滴的蛋白质界面膜,使油滴能够释放并聚集。因此,未冷冻前,燕麦蛋白质与脂质之间具有相互作用,形成的蛋白质-脂质结合物在中性条件下会沉降,经过冷冻处理后,冷冻条件下形成的冰晶使蛋白质与脂质间的相互作用被削弱,油滴被释放聚集,进入到清液中,所以沉降至OPI中的脂质含量降低,蛋白质含量升高。

2.1.5 冷冻时长对OPI蛋白质含量的影响

燕麦糊的冷冻时长与OPI中蛋白质含量的变化有密切联系,蛋白质含量随冷冻时长的延长先升高后降低,在冷冻10 h时,OPI的含量达到最大为92.31%,远超于未冷冻时的蛋白质含量77.65%,而蛋白质的提取率没有随着冷冻时长的改变而发生明显的变化。林畅[19]和程雪等[20]的研究发现在冷冻过程中,连续相产生的冰晶会刺穿界面膜进入油滴内部,解冻后引发油滴聚合；若冷冻时间过长,油相结晶增加缓慢,结晶达到最大程度,脂肪晶体刺穿界面膜的概率不再增加。因此综合来看,冷冻时长选为10 h时OPI的蛋白质含量和提取率均为最高。

图4 冷冻时长对OPI蛋白质含量的影响Fig.4 The effect of freezing time on OPI protein content

2.2 OPI与OPC的氨基酸分析

OPC与OPI的氨基酸含量见表3,可以看出OPI和OPC中谷氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和精氨酸含量较高；氨基酸评分AAS值见表4,OPC的AAS值在70～162,OPI的AAS值在42～166,说明燕麦蛋白氨基酸配比比较平衡,为优质的蛋白质资源。OPC中第一限制性氨基酸为赖氨酸,其AAS值为70；此结果与KLOSE等[21]的研究结果一致。而OPI中的限制性氨基酸为蛋氨酸、胱氨酸和赖氨酸。

表3 OPC与OPI的氨基酸组成 单位：g/100 g蛋白质

续表3

表4 OPC与OPI的氨基酸评分Table 4 OPC and OPI amino acid score

3 结论与讨论

本研究采用不引入有机溶剂的绿色加工工艺,以裸燕麦为原料,探究了提取pH、分级沉淀pH、冷冻处理等条件的影响,结果表明当提取pH为8.5,回调pH为7.2,冷冻10 h时,可以制备出蛋白质含量为92.61%、提取率为42.46%的OPI,接着对上清液在等电点pH 5.2下进行沉淀,可得到燕麦蛋白含量为65.14%,提取率为44.75%的OPC,此工艺流程可以提取出燕麦原料中大于80%的蛋白质,实现了燕麦中蛋白质资源的最大利用,而且全过程不引入任何有机溶剂与酶制剂,工艺符合绿色生产标准,此外OPI和OPC的氨基酸配比均十分均衡,是一种优质的植物蛋白资源,可应用于食品工业。