黄麻应用核心种质的DNA 分子身份证构建

2021-12-17郭艳春张力岚陈思远祁建民方平平陶爱芬张列梅张立武

作物学报 2021年1期

郭艳春张力岚陈思远祁建民方平平陶爱芬张列梅张立武,*

1 福建农林大学农学院作物遗传育种与综合利用教育部重点实验室 / 福建省作物设计育种重点实验室, 福建福州 350002; 2 福建农林大学农业农村部东南黄红麻实验观测站 / 福建省麻类种质资源共享平台 / 福建省南方经济作物遗传育种与多用途开发国际科技合作基地, 福建福州 350002; 3 福建农林大学海峡联合研究院基因组与生物技术中心, 福建福州 350002

黄麻是一年生草本植物, 世界上最重要的韧皮部纤维作物。黄麻属(Corchorus)有100 多个种, 在生产上有栽培价值的有圆果种黄麻(C. capsularisL.)和长果种黄麻(C. olitoriusL.), 两者皆为二倍体(2n=14)。其纤维具有产量高、纤维质地柔软的特点[1]。我国是世界上最古老的黄麻原产地之一, 种植黄麻已有近千年的历史, 古时黄麻又称“绿麻”、“络麻”, 早在北宋年间就已有黄麻形态特征的记载[2]。农作物种质资源是人类社会可持续发展不可替代的财富, 20 世纪40—60 年代, 我国就开始了黄麻种质资源的考察与搜集, 经过半个多世纪的艰苦努力, 我国黄麻种质资源已建立起完整的研究体系[3]。随着黄麻种质资源研究的深入, 发掘一批具有应用价值的优异种质资源可为黄麻遗传育种和生产利用提供必要的种质基础。

核心种质(core germplasm)有利于提高种质资源的利用效率。不同研究者构建了多种作物的核心种质, 如水稻[4]、小麦[5]、黄麻[6]、芝麻[7]等。随着核心种质的深入研究, 针对优异的育种目标性状, 以核心种质为基础, 构建具有代表性的应用核心种质(applied core germplasm)[8]在作物育种进程中具有重要意义。黄麻核心种质研究虽已有报道[6], 但黄麻应用核心种质的研究鲜有报道。

在众多的分子标记技术中, 简单重复序列SSR(simple sequence repeat)具有多态性高、数量丰富、重复性好等特点, 是一种比较理想的遗传标记[9-10]。张立武等[11]在黄麻EST 序列的基础上, 开发了66对SSR 引物; 陶爱芬等[12]利用黄麻转录组数据开发并验证了29 对SSR 引物, 这些SSR 为黄麻种质资源遗传多样性分析、分子标记辅助育种、遗传图谱构建和功能基因的挖掘等提供了有利工具。

为鉴别核心种质或应用核心种质之间的差异,越来越多的研究者利用分子标记来构建DNA 指纹图谱。目前指纹图谱的构建方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳法[13]、荧光毛细管电泳法[14]等。随着SSR 荧光标记毛细管电泳技术DNA 指纹图谱的快速发展, 在指纹图谱的基础上, 可将结果转化为字符串、条形码及二维码等, 称为DNA 分子身份证[15-17]。它可以不受环境因素的影响, 能精确、简洁地鉴定不同种质资源。目前, 黄麻种质资源指纹图谱的分子身份证构建工作研究较少。

本研究从不同来源的黄麻种质资源遴选出应用核心种质, 并通过SSR 荧光标记毛细管电泳技术构建黄麻应用核心种质的DNA 分子身份证, 以促进黄麻种质资源的高效利用及快速分子鉴定, 并为黄麻优异基因的挖掘奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从300 份黄麻种质资源[18]中鉴定评价出61 份品种(系), 均由福建农林大学麻类作物遗传育种与综合利用实验室提供。

1.2 试验设计与应用核心种质的构建

依据《黄麻种质资源描述规范和数据标准》[19],对种质资源的株高、茎粗、鲜皮厚、单株鲜皮重、出苗期、开花期、结果期、工艺成熟期、种子成熟期、生育日数、生育类型、叶形、果形、抗病性、耐旱性、耐盐性、抗倒伏性、种子发芽率进行鉴定评价, 收获后测定纤维素含量、木质素含量、纤维强度、纤维支数等构建出具有优异性状的包含61 份品种(系)的应用核心种质。

该应用核心种质分别于2018 年5 月1 日和2019年5 月8 日在福建省三明市尤溪县福建农林大学洋中科教基地农场(东经118°28′44′′, 北纬26°17′22′′, 海拔174 m), 按2 行区种植, 行长3.5 m, 行株距1.20 m × 0.10 m, 采用单因素随机区组设计, 边行种植2行保护行, 田间管理同大田。

1.3 DNA 提取

采用改良的CTAB 法提取黄麻基因组DNA[20]。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 完整性, 采用紫外分光核酸测定仪测定DNA 质量和浓度, 并将样品DNA 稀释至50 ng μL-1, -20℃保存备用。

1.4 SSR 引物

46 对预选引物序列信息见附表1, 所用的SSR引物包括编号CcID[18]、CoSSR[11]和CoEMS[20], 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。毛细管电泳荧光引物为单色荧光, 上游5′端加FAM (blue)或HEX (green)荧光基团标记, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

参照徐益等[6]PCR 体系、PCR 扩增的方法, 用荧光毛细管电泳分离PCR 扩增产物。荧光毛细管电泳采取一重单色毛细管电泳, 仪器为3730XL 测序分析仪。

1.5 荧光核心引物筛选及数据处理

从供试材料中随机选12 份材料, 通过PAGE 银染法对备选的46 对SSR 核心引物进行初筛, 每个引物进行3 次重复, 选取多态性高、重复性好的引物合成荧光引物。用PIC_Calc 0.6 软件计算多态性信息量(PIC)。

1.6 DNA 分子身份证构建方法

采用SSR 荧光标记毛细管电泳技术, 用获得的核心引物分析该应用核心种质, 用3730XL 测序列分析仪读取数据, 获得SSR 扩增片段的精确分子量,并进行数字+英文字母编码。将每对引物扩增所有样品的不同带型, 按分子量从大到小用数字1～9 依次表示, 超出9 的用英文字母A～Z 依次表示, 构建字符串形式的DNA 分子身份证。将对应字符串导入在线条码生成器(http://barcode.cnaidc.com/html/BCG code128b.php), 生成可供扫描的条形码DNA 分子身份证; 将应用核心种质的基本信息、形态特征特性、品质数据、DNA 分子身份证代码等文本信息输入在线二维码生成器(https://cli.im/), 生成可扫描的二维码DNA 分子身份证。

2 结果与分析

2.1 应用核心种质的构建

通过包含61 份品种(系)的应用核心种质农艺性状精准鉴定, 筛选出纤维产量高(包括高秆、茎粗、鲜皮厚、单株鲜皮重)、纤维品质好(包括高纤维素含量、低木质素含量、高纤维强度、高纤维支数)、抗逆(包括抗炭疽病、抗盐、抗旱、高发芽率、抗种子老化)、生育期适宜、适宜机械化(抗倒伏)等应用核心种质, 加上6 份骨干亲本, 按特性可分为16 个应用型, 即16 组(表1)。剔除不同组内同一种质, 共61份品种(系)。

表1 黄麻应用核心种质Table 1 Applied core collection of jute

(续表1)

2.2 应用核心种质SSR 核心引物的确定

从该应用核心种质的61 份品种(系)中随机挑选12 份作为模板, 采用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR 扩增产物。针对备选的46 对SSR 核心引物进行初筛, 得到12 对多态性高且条带清晰的引物, 如表2 所示。利用SSR 荧光标记毛细管电泳技术及这12 对核心引物扩增61 份应用核心种质。共检测到140 个多态性位点, 等位位点多态性信息含量(PIC)变幅为0.8223～0.9499。

2.3 应用核心种质DNA 分子身份证编码及构建

12 对核心引物对该应用核心种质进行SSR 荧光标记毛细管电泳, 3730XL 测序列分析仪读取分子量数据。图1 为引物CcID071(FAM)荧光毛细管电泳检测到的 19 种特征带型, 对应的片段大小分别为104/113、108/129、112/128、113、113/117、113/125、113/126、113/128、113/129、114、114/126、114/129、116/125、117、119/126、122、125、126、129 bp。图2 为引物CcSSR024(HEX)荧光毛细管电泳检测到的4 种特征带型, 对应的片段大小分别为196、197、199、200 bp。表3 为各核心引物5′端标记的荧光基团、扩增得到的多态性条带总数、多态性片段大小及编码汇总。

利用毛细管电泳多态性片段及编码信息构建DNA 分子身份证。对毛细管电泳结果按表3 进行数字+英文字母编码, 将 CcID071、CoSSR083、CoSSR146、CoSSR179、CoSSR049、CcSSR001、CoSSR119、CoSSR133、CoSSR136、CcSSR024、CcSSR015、CoEMS333 这12 对引物的排列组合用于DNA 分子身份证的构建。按上述顺序将该12 对引物对应的编码组合, 构成应用核心种质DNA 分子身份证, 即字符串DNA 分子身份证。如巴长4 号(种质编号: 16)的DNA 分子身份证编码为I2457612J227,对照表3, 第1 个字母I 表示引物CcID071 在种质16 中的扩增片段, 在其多态性片段梯度中排第18 位,第2 个数字2 表示引物CoSSR083 在种质16 中扩增的片段, 在其多态性片段梯度中排第2 位, 其余代码依次类推。将DNA 分子身份证编码导入在线条码生成器, 生成条形码DNA 分子身份证。将应用核心种质的主要描述符和DNA 分子身份证编码导入二维码生成软件, 生成二维码DNA 分子身份证。基于字符串、条形码、二维码3 种形式, 成功构建出61份应用核心种质的DNA 分子身份证, 图3 为构建的应用核心种质条形码 DNA 分子身份证和二维码DNA 分子身份证示例。

3 讨论

3.1 黄麻应用核心种质的利用价值

表3 12 对核心引物毛细管电泳结果及带型编码Table 3 Amplification results and code typing of 12 pairs of core primers detected with capillary electrophoresis

黄麻是我国重要的纤维作物, 构建应用核心种质是促进优异基因的深入发掘和提高育种利用效率的有效途径。本研究构建了包括16 种优异应用型在内的黄麻应用核心种质, 可以精准地为黄麻多元化及专用化育种提供研究材料。例如, 高产、高发芽率、高纤维素含量、低木质素含量、高纤维强度、高纤维支数应用核心种质可用于黄麻的品种改良,抗倒伏应用核心种质将为选育理想株型及适宜机械化的黄麻品种提供关键亲本, 抗炭疽病、抗盐、抗旱应用核心种质在多抗黄麻品种的选育方面具有重要利用价值。同时, 这批应用核心种质的构建也将为黄麻高产、纤维优质、抗逆等优异基因的发掘及功能标记开发等基础研究提供核心材料, 如卢瑞克等[21]在研究盐胁迫下的生理响应时需选择强耐盐材料和盐敏感型材料, 徐益等[22]在鉴定与萌发速率相关的SSR 标记时需选择高发芽率的材料, 陶爱芬等[23]在筛选与黄麻炭疽病抗性相关的新型分子标记研究中需要高抗炭疽病材料和高感炭疽病材料。

3.2 荧光核心引物的筛选

筛选一批多态性高、重复性好、具有代表性的标记在DNA 分子身份证构建中至关重要。SSR 分子标记已成为一种最广泛应用的具有高稳定性的分子标记, 目前SSR 扩增产物检测方法主要有聚丙烯酰胺凝胶银染法和荧光毛细管电泳法2 种。郝晨阳等[24]对2 种方法比较分析认为, 荧光标记技术的检测效率显著高于银染法, 且PAGE 法存在读带不准确、对人体有害等缺点, 而SSR 荧光标记毛细管电泳法可以得到目标DNA 片段的准确大小, 检测结果更为准确、高效。本研究确定的12 对荧光核心引物多态性较高, 稳定性较好, 均匀分布于7 条染色体上, 且能达到最少标记区分最多品种的目的。

3.3 DNA 分子身份证的优越性

DNA 分子身份证是证实和区分不同材料的有效证明, 具有唯一性、可鉴别性等特点。本研究构建的包含61 份品种(系)的应用核心种质的字符串、条形码和二维码DNA 分子身份证, 为每份品种(系)独有的分子身份证, 其号码是唯一的。基于字符串,本研究构建了能够迅速被电子系设备识别的条形码DNA 分子身份证, 但是其无法储存大量文字等有效信息。而如今二维码技术的运用有效地容纳了数字、文字、字母、图片等信息, 且能够迅速被电脑、手机等电子设备全方位识别, 大大增加了其使用范围。这些技术的运用使我们构建的黄麻应用核心种质DNA 分子身份证可以在种质鉴定和保护上发挥重要作用; 也可以用于黄麻种质资源库的完善与智能化管理, 为构建标准化的黄麻种质DNA 分子身份证库奠定了重要的技术基础。目前, 陆徐忠等[16]构建了水稻品种分子身份证, 高源等[17]构建了苹果部分种质资源分子身份证, 杨文娟等[7]构建了芝麻应用核心种质的DNA 分子身份证, 他们都采用了条形码或二维码的方式, 来增加分子身份证的实用性。本研究对于黄麻应用种质的DNA 分子身份证构建在国内外尚属首例, 这将在中国黄麻种质资源保存和利用研究中有广阔的应用前景。