血清微小核糖核酸-599 与肝细胞肝癌TACE 治疗预后的相关性
2021-12-16张志强蔡恒烈
王 奕, 韩 涛, 张志强, 崔 刚, 廖 搴, 蔡恒烈
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第二大恶性肿瘤,严重危害着人们健康。 中国是HCC 的高发国家,发病人数约占全球HCC 患者总数的 55%[1]。 目前,尽管针对 HCC 的诊断及治疗取得了一定进展, 但HCC 患者的5 年总生存率仍不足10%[2]。 有研究指出,对于相同肿瘤分期的 HCC,经肝动脉化疗栓塞(transhepaticarterialchemoembolization,TACE)的治疗效果存在一定差异[3]。因此,早期评价HCC 治疗效果,不仅可节约医疗资源,还可达到精准治疗的目的[3]。 文献报道,微小核糖核酸-599(miR-599)参与了甲状腺乳头状癌[4]、神经胶质瘤[5]和膀胱尿路上皮癌[6]等发病和进展过程,并与预后有关。此外,miR-599 还可调节HCC 细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等过程[7-8]。 本研究选取 TACE 治疗的 HCC患者作为研究对象, 分析miR-599 与预后的关系,以期为改善HCC 预后提供帮助。
1 材料与方法
1.1 一般资料
纳入 2016 年6 月至 2018 年 2 月在江西省萍乡市人民医院确诊并接受治疗的166 例HCC 患者,男 108 例,女 58 例;年龄为(62.2±4.7)岁,范围为 48~70 岁。 Child-Pugh A 级 124 例,B 级 42 例;HBsAg 阳性 137 例,阴性 29 例;甲胎蛋白≤400 μg/L 69 例,>400 μg/L 97 例;肿瘤单发 63 例,多发 103 例;肿瘤直径≤5 cm 87 例,>5 cm 79 例;肿瘤分期:Ⅰb期 16 例,Ⅱ期 70 例,Ⅲa 期 80 例;TACE 次数:1 次111 例,2 次 26 例,3 次 29 例;索拉非尼:接受 19 例,未接受 147 例;血管侵犯:有 80 例,无 86 例。 HCC诊断参照《原发性肝癌诊疗规范(2019 年版)》[9],有典型的肝癌影像学表现,病灶>2 cm 或肝占位性病灶经病理组织学或细胞学检查证实。 纳入标准:①年龄<80 岁;②接受TACE 治疗;③签署了知情同意书。 排除标准:①Child-Pugh C 级;②临床信息不完整;③合并其他恶性肿瘤;④合并血液系统疾病;⑤获取血液样本前接受了放化疗、靶向治疗或免疫治疗等。
所有研究对象对研究内容知情同意,签署知情同意书。 本研究经江西省萍乡市人民医院医学伦理委员会批准(2016R-239KS)。
1.2 TACE 治疗方案
术前检查所有受试者血常规、尿常规、凝血功能等。 手术步骤:消毒、铺巾,行局部麻醉,采用Seldinger 法由股动脉入路插入导管至腹腔动脉或肝总动脉,行血管造影检查,明确癌组织的供血情况;将化疗药奥沙利铂(江苏奥赛康药业股份有限公司,国药准字:H20064296,100 mg/m2)和 5-氟尿嘧啶(上海旭东海普药业有限公司, 国药准字:H31020593,500 mg/m2)稀释,缓慢灌注至癌组织的供血动脉,用乳化充分的超液化碘油(烟台鲁银药业有限公司,国药准字:H37022398)和阿霉素(瀚晖制药有限公司,国药准字:H33021980,40 mg/m2)的混悬液栓塞,注入明胶海绵颗粒[杭州艾力康医药科技有限公司,国食药监械(准)字2014 第3771056 号]栓塞,直至癌组织供血动脉呈“干树枝”状;拔出导管和导管鞘,局部加压止血。术后给予保肝、止吐等药物治疗,医嘱术后4 周复诊,行CT 检查,根据癌组织坏死情况制定后续治疗方案,TACE 后肿瘤复发的患者,再次给予TACE 治疗;TACE 治疗无效的患者,联合消融(本研究中不包含接受消融治疗的患者)或靶向药物。
1.3 miR-599 表达量检测
实时荧光定量 PCR 检测血清 miR-599 表达量[10]。抽取受试者TACE 术前1 d 和术后28 d 肘部静脉血10 mL,离心后吸取上清液,置于 EP 管中,-80℃冰箱中保存。 实验步骤:取冻存的血清,解冻后用TRIzol 试剂(日本 Takara 公司)提取总 RNA,用 752型紫外分光光度计(上海光学仪器五厂有限公司)检测RNA 纯度; 用反转录试剂盒(日本TaKaRa 公司)将 RNA 反转录为 cDNA;用 Q1600 型 PCR 仪(杭州柏恒科技有限公司)扩增产物,条件为95 ℃10 min,95 ℃ 60 s,35 个循环,60 ℃ 60 s,72 ℃ 60 s。miR-599 上游序列:5'-TAAGCTGACATGGGACAGG GAT- 3', 下 游 序 列 :5'- CTCCATATCGCACTTTA ATCTCTAACT-3'; 内参 U6 上游序列:5'-CTCGCT TCGGCAGCACA-3', 下游序列:5'-ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3'。 选取同期参加体检的20 名年龄、性别与HCC 患者匹配的健康人的样本作为对照,用2-DDct法计算HCC 患者血清中miR-599 的相对表达量。
1.4 随访
采用复诊和电话随访方式获取受试者3 年生存结局,于受试者出院后1 个月复诊,此后每3~6个月随访 1 次, 末次随访时间为2021 年 2 月 23日,中位随访时间为36(6~36)个月。
1.5 统计学方法
应用SPSS 23.0 软件包进行统计分析。 正态分布的计量资料以表示,2 组间比较采用独立样本t 检验,TACE 前、后 miR-599 的相对表达量比较用重复测量方差分析;非正态分布的计量资料以M(Q1,Q3)表示,2 组间比较采用 Mann-Whitney U 检验。计数资料以例数表示,组间比较采用χ2检验。用受试者工作特征(receiver operating characteristics,ROC)曲线下面积评价miR-599 诊断HCC 预后的价值。用Cox 回归分析miR-599 与TACE 治疗HCC预后的关系。 P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 生存组和死亡组患者临床特征比较
根据HCC 患者的3 年生存结局将其分为生存组113 例和死亡组53 例。 生存组和死亡组的年龄、性别构成、HBsAg、肿瘤数目和接受TACE 治疗次数构成比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);生存组的 Child-Pugh A 级、AFP≤400 μg/L、肿瘤直径≤5 cm、 肿瘤分期Ⅰb 期和接受索拉非尼治疗的例数均高于死亡组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。见表1。
按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,生存组和死亡组的年龄、 性别构成、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期和接受TACE 治疗次数比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。 见表 1。
表1 生存组和死亡组患者的临床特征比较
2.2 生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量比较
生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量差异有统计学意义(F=66.799,P<0.01),生存组术前、术后的miR-599 相对表达量均高于死亡组,差异均有统计学意义(P<0.05);术前、术后的 miR-599 相对表达量差异有统计学意义(F=232.151,P<0.01),生存组和死亡组的术后miR-599 相对表达量均较术前升高,差异均有统计学意义(P<0.05);生存结局和时间之间无交互作用(F=3.843,P=0.052)。 见表 2。
按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,生存组和死亡组的miR-599 相对表达量差异有统计学意义(F=12.267,P=0.001),生存组术前、术后的 miR-599 相对表达量均高于死亡组, 差异均有统计学意义(P<0.05);术前、术后的 miR-599 相对表达量差异有统计学意义(F=37.369,P<0.01),生存组和死亡组的术后miR-599 相对表达量均较术前升高,差异均有统计学意义(P<0.05);生存结局和时间之间无交互作用(F=1.258,P=0.269)。 见表 2。
表2 生存组和死亡组患者miR-599 相对表达量比较
2.3 miR-599 诊断HCC 预后的价值分析
术前miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599,差异有统计学意义(Z=2.603,P=0.009),见表 3。
按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,术前miR-599 诊断 HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599,但差异无统计学意义(Z=0.961,P=0.337),见表 3。
表3 miR-599 诊断HCC 预后的价值分析
2.4 HCC 生存预后的Cox 回归分析
将HCC 预后作为因变量,将年龄、性别、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期、TACE 次数、 接受索拉非尼治疗和术前miR-599 作为自变量,分别纳入Cox 回归分析,结果显示Child-Pugh 分级、AFP、肿瘤直径、肿瘤分期和术前miR-599 与 HCC 预后有关(P<0.05)。 将 HCC 预后作为因变量,将Child-Pugh 分级、AFP、肿瘤直径、肿瘤分期、 术前miR-599 和接受索拉非尼治疗作为自变量(纳入标准为单因素Cox 回归分析的P<0.10 或已知与HCC 生存预后有关),一并纳入Cox 回归分析, 结果显示肿瘤直径>5 cm 和肿瘤分期高是HCC 预后的独立危险因素(P<0.05),接受索拉非尼治疗和术前miR-599 表达量高是HCC 预后的独立保护因素(P<0.05)。 见表 4。
表4 HCC 生存预后的Cox 回归分析结果(倾向性评分匹配前)
按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,将HCC预后作为因变量, 将年龄、 性别、Child-Pugh 分级、HBsAg、AFP、肿瘤数目、肿瘤直径、肿瘤分期、TACE次数和术前miR-599 作为自变量(1∶1 倾向性评分匹配后不包含接受索拉非尼治疗的患者), 分别纳入Cox 回归分析,结果显示术前miR-599 与HCC 预后有关(P<0.05)。将HCC 预后作为因变量,将肿瘤数目、肿瘤分期和术前miR-599 作为自变量一并纳入Cox 回归分析, 结果显示术前miR-599 表达量高是HCC 预后的独立保护因素(P<0.05)。 见表 5。
表5 HCC 生存预后的Cox 回归分析结果(倾向性评分匹配后)
3 讨论
目前,已有多数miRNA 被报道与HCC 预后有关,如 miR-542-3p、miR-139 和 miR-100-5p 等[11-13]。本研究主要分析血清miR-599 与TACE 治疗HCC 预后的关系。 既往文献报道,接受TACE 治疗的HCC患者3 年生存率为72.12%[14],本研究中接受 TACE治疗的HCC 患者3 年生存率为68.07%, 存在一定差异,其原因可能与样本量大小、肿瘤分期构成等有关。
为避免混杂因素影响统计分析结果的准确性,本研究采用最邻近原则进行了1∶1 倾向性评分匹配,从生存组和死亡组中抽选临床特征匹配的42 例患者进行比较。 结果显示,生存组和死亡组患者术后miR-599 相对表达量均较术前升高, 提示miR-599相对表达量与TACE 治疗有关; 且生存组术前、术后的miR-599 相对表达量均高于死亡组, 提示术前、术后的miR-599 相对表达量与TACE 治疗HCC预后有关,是HCC 预后评估的潜在生物标志物。 本研究构建了术前、 术后的miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线,结果显示术前miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599,提示术前miR-599 诊断HCC 预后的价值较术后miR-599 高;按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,虽术前和术后的miR-599 诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积差异无统计学意义, 但术前miR-599 诊断HCC预后的ROC 曲线下面积高于术后miR-599,因此认为术前miR-599 对HCC 预后评估有一定价值。
本研究用Cox 回归分析了HCC 预后的风险因素, 结果显示术前miR-599 是HCC 生存预后的独立保护因素;按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后, 结果亦显示术前miR-599 表达量高仍是HCC预后的独立保护因素。 推测其原因有以下两点:一是过表达miR-599 可靶向MYC 抑制 HCC 细胞增殖、迁移和侵袭[7];二是过表达 miR-599 可靶向富含丝氨酸/精氨酸剪接因子2 抑制HCC 细胞活力、迁移和侵袭,促进细胞周期停滞和凋亡[8],miR-599 表达量与HCC 细胞的增殖、 凋亡、 侵袭和迁移等有关,进而可反映HCC 患者TACE 治疗获益。
既往研究结果显示, 肿瘤直径和肿瘤分期与HCC 生存预后独立相关[15-16]。本研究结果也显示,肿瘤直径>5 cm 和肿瘤分期高是HCC 生存预后的独立危险因素, 接受索拉非尼治疗是HCC 生存预后的独立保护因素,与上述报道结果一致。按1∶1 倾向性评分匹配(最邻近原则)后,结果显示肿瘤直径>5 cm 和肿瘤分期高并非HCC 生存预后的独立危险因素,推测该差异可能与倾向性评分匹配后样本量小有关,后续还需增大样本量,进一步进行分析。
综上所述, 术前 miR-599 与 HCC 患者 TACE治疗预后有关,其表达量低提示预后不良风险高。 本研究尚存在一定不足, 如仅分析了血清miR-599 与TACE 治疗的HCC 患者预后的关系,未分析其与接受其他治疗方案的HCC 患者预后的关系, 后续将开展大样本、多中心研究进行分析,以充实本研究结论。