Necrostatin-1在高糖环境下促巨噬细胞氧化应激反应中的作用及机制

周婷 周雪 宋斌

贵州省人民医院口腔科，贵阳550002

牙周炎是发生在牙周支持组织的慢性炎症性疾病，是成年人失牙的最主要原因[1]。第四次全国口腔流行病学调查[2]结果显示，在35～44 岁的成年人中，缺失牙及全口失牙的比例分别是84.4% 和1.8%。此外，全球范围内患有重症牙周炎的患者有近8 亿，全口失牙的患者为2.67 亿[3]。因此，牙周炎已经成为威胁人类健康的重要口腔疾病。近年来大量研究[4-5]表明，全身健康状况对牙周炎的发生发展具有促进作用，其中糖尿病已被证实是牙周炎的重要危险因素。中国糖尿病的患病率为14.8%，大约1.1 亿成年人患有糖尿病，居世界首位，已成为威胁人民健康的重大慢性疾病[6-8]。因此深入探讨糖尿病促牙周炎发生发展的分子机制，对于进一步揭示牙周炎的发病机制以及对牙周炎的防治具有重大意义。

细胞凋亡、细胞自噬作为目前研究较深入的程序性细胞死亡方式（programmed cell death，PCD），已被证实参与糖尿病相关牙周炎的发生发展[9]。课题组的前期文献综述[10]发现，程序性细胞坏死为另一种新的PCD，参与调控牙周炎的发生发展；并有研究[11]表明，程序性细胞坏死也参与了糖尿病相关牙周炎的发生发展。受体相互作用蛋白1 （receptor interacting protein 1，RIP1） 是调控程序性细胞坏死的重要基因之一，能够调控细胞死亡及炎症反应[12-13]。研究表明，RIP1既参与了牙周炎的发生发展[14]，也能够调控糖尿病的发展进程[15]。课题组的前期细胞实验[16]也证实，高糖环境能够促进牙周组织中重要细胞——巨噬细胞发生炎症反应。程序性细胞坏死特异性抑制剂Necrostatin-1 （Nec-1） 能够通过下调RIP1的表达，减轻高糖环境对细胞的促炎作用[17-19]。Nec-1 作为RIP1的特异性抑制剂，除了能够抑制炎症反应外[20]，还能够抑制氧化应激反应[21-22]。由于氧化应激反应是糖尿病相关牙周炎的一个重要发病机制[23-25]。而糖尿病能否通过调控RIP1 的表达影响牙周组织的氧化应激反应，目前还未见相关报道。因此本文在前期研究基础上，继续采用细胞实验，对Nec-1能否减轻高糖环境对巨噬细胞氧化应激反应的促进作用及其分子机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Nec-1 （MCE 公司，美国），2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针DCFA-DA、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD） 酶联免疫吸附试剂盒（南京建成生物工程研究所）；RIP1、β-连环蛋白（β-catenin） 抗体（CST 公司，美国）；培养基、胎牛血清（Invitrogen 公司，美国）；互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA） 合成试剂盒、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） 试剂盒（GeneCopoeia公司，美国）。

1.2 巨噬细胞的诱导及分组处理

THP-1人单核细胞株（购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），培养于含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 的杜氏改良细胞培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中，培养条件为37 ℃、5%CO2、饱和湿度，采用课题组前期研究[19]的方法，给予终浓度50 ng·mL-1的佛波酯（PMA） 诱导THP-1 细胞，每2 d 换液1次，将其诱导成巨噬细胞，巨噬细胞的分组处理如下。

1.2.1 高糖对巨噬细胞氧化应激反应的影响 将用佛波酯诱导分化成功的巨噬细胞分为两组：对照组与高糖组分别给予含葡萄糖浓度5.5 mmol·L-1与25 mmol·L-1的培养基培养，两组细胞均培养72 h后，流式细胞术检测巨噬细胞内ROS 含量，试剂盒检测MDA与SOD水平。

1.2.2 Nec-1 在高糖环境下对巨噬细胞氧化应激反应的影响及RIP1 表达的影响 分为3 组：正常葡萄糖浓度（5.5 mmol·L-1）培养的对照组、高糖组（25 mmol·L-1葡萄糖）、 高糖+Nec-1 （5 μmol·L-1）组。3组细胞均培养72 h后，流式细胞术检测巨噬细胞内ROS 含量，MDA 与SOD 的生化试剂盒分别检测MDA与SOD水平。

1.2.3 RIP1 在高糖环境下对巨噬细胞氧化应激反应的影响 采用课题组前期研究[19]的方法构建基因缺陷型细胞，即设计并合成3 条靶向RIP1 mRNA的干扰片段与阴性对照片段，将干扰片段分别转染进巨噬细胞中，经实时荧光定量（quantitative real-time，qRT）-PCR 检测，确定干扰成功后使用最佳干扰效率的一条做后续实验。巨噬细胞分组如下：高糖+si-NC组、高糖+si-RIP1组。巨噬细胞在高糖环境处理下，给予干扰片段处理，72 h 后，流式细胞术检测巨噬细胞内ROS 含量，试剂盒检测MDA与SOD水平。

1.3 ROS含量的检测

采用DCFA-DA 荧光探针检测巨噬细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平：巨噬细胞分组处理结束后，加入10 μmol·L-1的DCFA-DA 荧光探针继续培养30 min，无血清DMEM 洗涤细胞2～3次，采用流式细胞仪检测ROS含量。

1.4 MDA及SOD活性的检测

巨噬细胞经上述1.2 中各个分组（对照组；高糖组；高糖+Nec-1 组；高糖+si-NC 组；高糖+si-RIP1 组） 处理后，使用MDA 及SOD 活性试剂盒检测每组细胞MDA及SOD活性，实验步骤严格按照检测试剂盒说明书进行。

1.5 qRT-PCR检测RIP1的基因表达

给予分组处理后的巨噬细胞，按照试剂盒的要求用Trizol 法提取细胞总RNA，按照常规qRTPCR 方法，对RIP1 的基因表达进行检测，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 为内参基因。

1.6 蛋白质印迹法检测RIP1的蛋白表达

巨噬细胞分组处理后，弃去上清液，加入100 μL的裂解液，离心15 min，收集上清液，蛋白质印迹法对RIP1进行半定量检测。

1.7 统计方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 软件处理数据，计量数据按均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多于两组的组间比较用单因素方差分析，P＜0.05即认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖环境对巨噬细胞氧化应激的影响

流式细胞术检测ROS 的结果显示，高糖组细胞内的ROS 含量（图1） 显著高于对照组（P＜0.000 1）。MDA 与SOD 试剂盒检测结果显示MDA活性（图2A） 也较对照组显著上调（P＜0.000 1），SOD活性（图2） 较对照组显著降低（P＜0.000 1）。这些结果表明，高糖环境诱发巨噬细胞发生氧化应激反应。

图1 高糖环境对THP-1来源的巨噬细胞ROS的影响Fig 1 The effects of high glucose on ROS of THP-1 derived macrophages

图2 高糖环境对THP-1 来源的巨噬细胞MDA 及SOD 活性的影响Fig 2 The effects of hig glucose on MDA and SOD levels of THP-1 derived macrophages

2.2 Nec-1 在高糖环境下对巨噬细胞氧化应激反应中的影响

流式细胞术检测ROS 的结果如图3 所示，高糖+Nec-1 组中细胞ROS 含量显著低于高糖组（P＜0.000 1）。MDA 与SOD 检测试剂盒检测结果显示（图4），与高糖组相比，在高糖+Nec-1 组MDA 活性显著下调（P＜0.000 1），SOD 活性（图4） 显著上升（P＜0.01）。表明Nec-1 缓解高糖对巨噬细胞氧化应激反应的促进作用。

图3 Nec-1在高糖促细胞ROS上升中的作用Fig 3 The effects of Nec-1 on high glucose-induced ROS

图4 Nec-1在高糖致细胞MDA、SOD表达改变中的作用Fig 4 The effects of Nec-1 on high glucose-induced MDA and SOD

2.3 Nec-1 对高糖环境下巨噬细胞中RIP1 表达的影响

巨噬细胞在高糖环境下给予Nec-1 过表达后，qRT-PCR及WB检测RIP1的表达。qRT-PCR与WB结果如图5 示，高糖组RIP1 mRNA 及蛋白表达水平显著高于对照组（分别为P＜0.001、P＜0.000 1）；高糖+Nec-1 组RIP1 基因及蛋白表达却显著低于高糖组（P＜0.000 1），这提示RIP1 参与高糖环境促巨噬细胞的氧化应激反应。

图5 Nec-1对高糖环境下巨噬细胞中RIP1表达的影响Fig 5 Effect of Nec-1 on the expression of RIP1 in macrophages under high glucose

2.4 RIP1 对高糖环境下诱导巨噬细胞氧化应激的影响

qRT-PCR 实验结果显示：RIP1 基因表达得到有效沉默（P＜0.001）（图6A）。流式细胞术检测ROS的结果显示：与高糖+si-NC 组相比，高糖+si-RIP1 组的ROS 含量显著降低（图6B～D）。MDA与SOD 检测试剂盒检测结果显示（图6E、F）：高糖+si-RIP1 组的MDA 活性显著低于高糖+si-NC 组（P＜0.001）；高糖+si-RIP1 组的SOD 活性显著高于高糖+si-NC组（P＜0.000 1）。综上，氧化应激指标的结果表明，沉默巨噬细胞内RIP1 的表达，能够缓解高糖环境诱导的氧化应激反应。

图6 RIP1在高糖促细胞氧化应激反应中的作用Fig 6 The role of RIP1 on high glucose-induced oxidative stress

3 讨论

本研究在课题组前期研究的基础上，采用高糖环境（25 mmol·L-1的葡萄糖） 刺激THP-1 来源的巨噬细胞作为细胞模型，来探讨糖尿病对牙周组织氧化应激反应的影响及分子机制。有研究报道，糖基化终末产物能够通过上调牙周膜干细胞的ROS 含量，激活了JNK 信号通路，从而导致细胞凋亡的发生[26]；此外，高糖环境能够通过上调ROS 含量及MDA 活性、降低SOD 活性，抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力[27]；高糖环境还能通过上调细胞ROS 含量，抑制牙龈成纤维细胞的增殖和迁移[28]，同时诱发牙龈上皮细胞的炎症反应[29]。上述研究提示，氧化应激反应在糖尿病促牙周炎发生发展中具有重要作用，高糖环境所诱发的氧化应激反应，能够影响牙周细胞的生物学功能，并能导致牙周细胞发生炎症反应。本研究同样证实了高糖环境能够诱导牙周组织的重要细胞——巨噬细胞发生氧化应激反应（图1、2），与上述研究具有一致性。那么高糖环境促进巨噬细胞氧化应激反应的分子机制是什么？

课题组在前期研究中发现，RIP1 的特异性抑制剂Nec-1能够抑制高糖环境对巨噬细胞的促炎作用，但其能否抑制氧化应激反应，目前尚未见相关报道。研究表明，Nec-1 能够抑制氯化钴所诱发的骨骼肌细胞氧化应激状态[30]，还能抑制神经细胞的氧化应激损伤[31]。Nec-1 能够通过对氧化应激反应的有效抑制，减轻中暑导致的肠道损伤[32]、减轻肾脏缺血再灌注损伤[21]，以及减轻顺铂导致的肾毒性[33]。上述研究表明，Nec-1 除了具有抗炎作用，还具有抗氧化应激的作用，并能通过其抗氧化应激的特性，减轻氧化应激所导致的其他病理改变。因此本研究对Nec-1在高糖环境促巨噬细胞氧化应激反应中的作用也进行了探讨，如图3和图4 所示，Nec-1 能够抑制高糖环境对巨噬细胞氧化应激反应的促进作用，与上述结果保持一致性。鉴于RIP1 是Nec-1 的主要作用靶点，课题组检测了RIP1 的表达量，结果显示Nec-1 能够抑制高糖环境对细胞RIP1 表达的促进作用，提示RIP1 可能参与了氧化应激反应。研究表明，RIP1 能够导致线粒体功能紊乱从而促进ROS 含量的上调[34]，还能通过诱发氧化应激反应而促进压迫环境下髓核细胞的凋亡[35]，但RIP1 在糖尿病促牙周炎发生发展中的作用尚不明了。课题组采用小干扰RNA 技术有效沉默巨噬细胞的RIP1 表达，进一步探讨RIP1 在高糖环境促巨噬细胞氧化应激反应中的作用。转染了si-RIP1 及si-NC 的巨噬细胞在高糖环境中培养后，课题组再次检测氧化应激相关指标的改变，结果显示，沉默RIP1 后，能够抑制高糖环境对巨噬细胞氧化应激反应的促进作用，该结果也与上述研究的结论相一致。但RIP1 通过何种机制调控高糖环境促巨噬细胞发生氧化应激反应，将在今后的研究中进一步去探讨。

综上所述，本实验证实了高糖环境通过上调RIP1的表达，从而促进巨噬细胞的氧化应激反应。通过本研究，能够进一步丰富糖尿病促牙周炎发生发展的分子机制，同时为牙周炎的防治提供理论依据。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。