纳米材料蛋白冠的非原位和原位表征技术研究进展

程世超

(济南职业学院，山东济南 250000)

纳米医学是致力于纳米材料医学应用的科学领域[1]。近年来，作为治疗和诊断试剂，纳米材料得到了飞速发展，与此同时，靶向给药的纳米给药系统也取得了重大进展[2-3]。因此，为了预测纳米材料在生物体内的活动规律，必须了解纳米材料在生物界面上发生的相互作用。纳米材料一旦与生物液体接触并相互作用，就会暴露在活跃的生物分子(如酶、蛋白质、肽、氨基酸等)中，纳米材料表面会吸附一层或多层蛋白并形成冠状结构，从而将原纳米材料转化为具有生物成分的纳米材料，该冠状结构即所谓的蛋白质冠状结构(蛋白冠)[4-5]。蛋白冠主要由蛋白质组成，其他生物分子如糖、核酸和脂类也可能存在，但迄今为止研究甚少[6]。关于纳米材料和血浆蛋白之间相互作用的首次研究是在1996年进行的[7]，直到2007年，Lynch等[8]引入了蛋白冠的概念。一旦蛋白冠形成，纳米材料的合成属性被一种新的生物属性所取代，自身的物理化学性质和生物学特性会受到蛋白冠的影响。有研究表明，纳米材料周围蛋白冠的性质和组成可能影响其生物学特性。因此，蛋白冠的表征和分析是理解蛋白冠形成机制和功能的关键一步。蛋白冠组成和结构的分析技术可分为原位法和非原位法。非原位分析技术要求将蛋白冠-纳米材料复合物从生物环境中分离出来，即在体外分离和鉴定蛋白。相反，原位分析技术直接提供了纳米材料在生理环境中分散时蛋白冠的相关信息。笔者对纳米材料蛋白冠表征方法的研究进展进行了综述。首先，介绍了蛋白冠的形成和组成，然后讨论了目前应用广泛的蛋白冠的非原位分析技术。其次，介绍了当前研究发现的蛋白冠原位分析技术。最后，讨论了蛋白冠的分析技术在体内研究的差距、挑战和未来展望。

1 蛋白冠的形成和组成

纳米材料进入血液后，会由于自身高表面能而吸附蛋白，形成蛋白冠。根据相对亲和力的不同，可将蛋白冠分为硬蛋白冠和软蛋白冠[9]。纳米材料表面首先吸附亲和力强的蛋白，形成与纳米材料表面紧密结合的硬蛋白冠；然后亲和力弱的蛋白吸附在硬蛋白冠外层，不直接与纳米材料表面接触，形成松散结合的软蛋白冠。吸附在纳米材料上的蛋白质处于一个连续的解吸/吸附过程。蛋白质之间的亲和竞争对纳米材料表面的吸附是蛋白冠的组成随时间变化的原因[10]。

血浆由约4 000种蛋白质组成，其中一些蛋白质含量比较高[11]，但其与蛋白冠中的相对含量并不一致[12]。当纳米材料在血浆中孵育时，约有不同含量的125种蛋白质吸附在纳米材料表面[13]。这些蛋白质大多参与相同的细胞过程，即补体激活，病原体识别和凝血。免疫球蛋白G、血清白蛋白、纤维蛋白原、凝聚素和载脂蛋白通常存在于暴露于血浆后的大多数纳米材料的蛋白冠中。尽管在功能上具有相似性，但这些蛋白质对纳米材料的影响会受到物理化学性质的调控。此外，生物环境如孵化时间、温度、pH值和疾病等也会影响蛋白冠的组成。

2 蛋白冠的非原位分析技术

非原位分析技术要求将蛋白冠-纳米材料复合物从生物环境中分离出来，即在体外分离和鉴定蛋白。由于纳米材料的分离会导致软蛋白冠的丢失，引起分析结果不准确，因此，从血液中分离蛋白冠-纳米材料复合物是在体内模型中研究蛋白冠的主要难点之一。纳米材料给药后，离心制备血浆并回收。此时，蛋白冠-纳米材料复合物需要纯化并从未结合的血浆蛋白中分离。对于磁性纳米材料，可采用磁分离方法分离蛋白冠，并精确梯度去除蛋白冠，在离心过程中尽量减少破坏松散结合的蛋白质。如Sakulkhu等[14]采用非原位分析技术分离超顺磁氧化铁蛋白冠-纳米材料复合物。体内相互作用后，基于纳米材料磁性和不同的表面电荷，采用高磁场梯度磁反应从大鼠血浆中进行分离。对于非磁性纳米材料，可采用尺寸排除色谱(SEC)结合膜超滤分离蛋白冠-纳米材料复合物。例如从血浆中回收蛋白冠-金纳米材料复合物，可以通过SEC从未结合蛋白中分离，然后进行膜超滤，从而研究纳米材料的大小和形状在体内对蛋白冠的影响[15]。此外，在体内试验中回收的脂质体纳米材料也可以通过SEC结合膜超滤从过量的血浆蛋白中分离出来。Hadjidemetriou等[16]在对血液进行分离后发现，纳米材料在体内比体外吸附蛋白质的种类更多。蛋白冠显著降低了MoAb -脂质体纳米材料的靶向能力。

后续的蛋白质鉴定方法与体外试验使用的方法大致相同(见表1)。纳米材料表面蛋白冠可以通过可视化方法进行观察，如原子力显微镜(AFM)[17]，透射电子显微镜(TEM)[18]和扫描电镜(SEM)[19]等。Chong等[20]利用AFM检测了氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(rGO)纳米材料对血浆蛋白质的吸附。牛血清白蛋白在与GO孵育过程中形成复杂的聚集体。蛋白质分布和颗粒形态可以用AFM观察。研究发现，吸附蛋白质分布的差异与颗粒结构和孵育时间有关。此外，Ge等[21]观察了血液蛋白在碳纳米管(CNTs)的不同结合形态。用AFM测量单个CNT上每种蛋白质的分子数，发现CNTs与蛋白质芳香族残基的π-π堆积驱动吸附是CNTs吸附能力的关键，CNTs表面的蛋白层厚度约为2.5 nm。

表1 蛋白冠表征非原位分析技术

蛋白质定量分析可用于评价蛋白质吸附在纳米材料上的绝对含量。有研究通过结合BCA蛋白定量分析法和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对金属基纳米材料进行定量，可以测定每个纳米颗粒上的蛋白含量[22]。此外，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是基于蛋白质的分子量对不同分析范围的蛋白质吸附量进行定量的方法。从生物流体中分离蛋白冠后，其组成可以在体外确定，通过胰蛋白酶消化等步骤进一步检测电泳分离的蛋白。SDS-PAGE与液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)[23]结合常用来鉴定和定量分析纳米材料表面吸附的蛋白。

此外，等温滴定量热法[24]可用于评价纳米材料与蛋白质相互作用的强度和吸附动力学。圆二色谱[25]、傅里叶变换红外光谱[26]和核磁共振[27]可用于测定蛋白质的构象变化。这些传统的非原位分析技术被用来表征蛋白质冠的结构和理化参数。

3 蛋白冠的原位分析技术

与非原位分析技术不同，原位分析技术不需要对蛋白冠进行分离，可以在复杂的环境中直接检测蛋白冠相关信息。该技术可能更适合生物流体中蛋白质冠的表征。Pattipeiluhu等[28]研究了使用一种类似磷脂的双功能无偏光亲和标记探针IKS02原位捕获脂质体的蛋白冠。研究发现，离心分离得到的蛋白组成与光亲和法有明显不同，离心分离法中人血清白蛋白和补体3含量较高，而光亲和法中载脂蛋白含量较高。此外，在细胞存在的情况下，一种基于非光学的原位分析方法可用来定量检测纳米材料上吸附的蛋白冠[29]。在这种方法中，纳米材料用19F标记，然后用19F扩散顺序核磁共振检测扩散系数。研究表明，纳米材料在体内水和粒径的变化可以用来显示其聚集、降解和蛋白质吸附等行为。此外，荧光相关光谱[30]和高速暗场显微镜[31]也可用来原位检测生物流体中的纳米材料-蛋白冠复合物的水合粒径。

除水合粒径外，其他有关蛋白冠的信息也可以通过原位技术进行分析。在高度复杂的分散体和生物环境中，流式细胞术与微流控技术相结合可用于检测代表纳米材料表面生物识别的分子信息[32]。该方法以特异性物质的高亲和力为基础，结合量子点(QD)在所有波长范围的吸收截面高、发射带宽窄、亮度高、光稳定性高和易于修饰等特殊特性，将QD-抗体复合物滴定至蛋白冠-纳米材料复合物，直至与靶点全部结合，然后测定散射和荧光。此外，通过原位荧光共振能量转移可以研究QD的蛋白质吸附行为，包括亲和力和吸附取向[33]。通过该方法发现InP@ZnS QDs不同的手性影响了蛋白质的亲和力和吸附取向。通过微流控平台和电阻测量装置，可以实时原位监测和研究蛋白冠的形成[34]。该方法能够对动态环境中的流体流动进行精确控制，可用于模拟真实的生物环境。微流控技术与共聚焦激光扫描显微技术相结合也可用于研究蛋白冠形成的时间演化[35]。

目前对蛋白冠的研究大多基于硬蛋白冠，这是因为传统的基于从生物介质中分离纳米颗粒的非原位分析技术未能完全检测出软蛋白冠的成分并阐明其生物学意义。最近，原位分析技术被用于研究软蛋白冠。例如，利用低温透射电镜和同步辐射圆二色谱分析弱结合蛋白，揭示软蛋白冠原位形成的分子基础[36]。此外，原位点击化学反应也被用于鉴别二氧化硅和聚苯乙烯纳米颗粒的软蛋白冠和硬蛋白冠[37]。研究表明，软蛋白冠和硬蛋白冠的区别在于蛋白质结合强度不同。虽然有一小部分蛋白只存在于软蛋白冠中，但软蛋白冠和硬蛋白冠中的大部分蛋白组成相同。软蛋白冠主要通过其动态特性调节纳米材料与细胞的相互作用。

此外，相关研究还开发了基于纳米材料特殊蛋白的原位检测技术，这有助于确定靶向特异性细胞受体和内化途径等生物学作用。Gianneli等[38]报道了一种通过石英晶体微天平测量生物流体中蛋白冠-纳米材料复合物受体识别的定量方法。采用适当的单克隆抗体和QCM“三明治”生化分析形式，对表面暴露的转铁蛋白识别位点进行定量，转铁蛋白的数量与纳米材料的大小和表面化学性质有关。

4 总结与展望

目前关于蛋白冠的表征技术有很多种，包括较为成熟的非原位分析技术，可用于表征如蛋白冠-纳米材料复合物的大小、形貌，蛋白冠的定性定量分析等；还包括在生物流体等复杂环境中用于检测蛋白冠性质的原位分析技术。但这些技术仍存在一些局限性。首先，这些技术中的大多数没有考虑到蛋白质的构象变化。事实上，蛋白冠-纳米材料复合物的形成可以影响蛋白质分子的高级结构，而蛋白结构的改变会进一步影响纳米材料的物理化学性质及其生物效应。其次，对蛋白冠形成过程的分析还缺乏一个合适的相互作用动力学模型。合理的动力学模型有助于研究蛋白冠的形成及生物学效应。但这是一个具有挑战性的任务，因为大量的分子参与蛋白冠的形成，并且这一过程是动态过程，并在短时间内完成。最后，目前对蛋白冠性质的分析表征主要是在体外进行。然而，生物体内含有多种生物分子，并且具有一定的特异性。由于其复杂的环境，体内蛋白冠形成的准确表征比体外表征更加困难。因此，开发合适的体内蛋白冠表征技术是未来研究的重点。