HPLC指纹图谱结合化学模式识别的不同采收期酸枣仁质量对比研究

2021-12-15周洪亮翁燕邵怡霖黄亚威

中国中医药信息杂志 2021年12期

关键词：阿魏采收期酸枣仁

周洪亮，翁燕，邵怡霖，黄亚威

中药研究与开发

HPLC指纹图谱结合化学模式识别的不同采收期酸枣仁质量对比研究

周洪亮1，翁燕1，邵怡霖2，黄亚威1

1.南京中医药大学附属医院，江苏南京 210029；2.南京中医药大学，江苏南京 210046

建立不同采收期酸枣仁HPLC指纹图谱分析方法，通过指纹图谱动态变化及化学模式识别方法比较不同采收期酸枣仁化学成分指纹峰的差异，寻找差异性标志物，为酸枣仁最佳采收期的确定提供依据。采用HPLC，Agilent EC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），以乙腈-0.1%磷酸水为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长312 nm。采集不同采收期酸枣仁药材指纹图谱，对不同采收期酸枣仁进行相似度评价，运用聚类分析、主成分分析及正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）对样品进行化学模式识别研究。建立了酸枣仁药材的HPLC指纹图谱，共确定了14个共有峰，指认了2个成分，分别为斯皮诺素（4号峰）、6’’’-阿魏酰斯皮诺素（9号峰）；不同采收期的酸枣仁样品间相似度为0.906～1.000，不同的化学模式识别方法可对样品进行较好区分，OPLS-DA筛选出斯皮诺素等3个成分可能是影响酸枣仁质量的差异性标志物。通过HPLC指纹图谱和化学模式识别能够较好辨识影响酸枣仁质量的标志性成分，可为其最佳采收期的确定及质量控制提供依据。

酸枣仁；采收期；指纹图谱；聚类分析；主成分分析；正交偏最小二乘-判别分析；差异性标志物；质量控制

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Mill. var.（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子，具有宁心安神、养心补肝、敛汗之功[1]，主要用于失眠[2-5]、焦虑[6]、抑郁[7-8]等的治疗。

目前，酸枣仁主要来源于野生酸枣，其资源通常分布于无明确权属的山林。为获取更大利益，产地从业人员通常在八月中旬（酸枣尚未成熟时）开始大量抢收，即“抢青”采收，与药典规定的“秋末冬初采收成熟果实”存在较大差异。周赛男等[9]研究显示，42批2016年产酸枣仁中仅23批斯皮诺素含量合格，合格率为54.8%；32批2017年产酸枣仁中仅16批斯皮诺素含量合格，合格率仅为50.0%。可见，斯皮诺素不合格现象非常严峻，其原因可能与酸枣仁“抢青”采收相关。目前关于“抢青”采收对酸枣仁的质量影响主要以监测斯皮诺素、酸枣仁皂苷含量为主[9-12]，尚未见采用指纹图谱对不同采收期酸枣仁化学成分进行全程监控，并结合多元统计分析对成熟度进行判断的报道。

本研究利用HPLC建立不同采收期酸枣仁的指纹图谱，从整体水平表征不同采收期酸枣仁化学成分变化情况，并利用聚类分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）对各样品进行识别归类，筛选不同采收期酸枣仁化学成分差异性的主要标志物，为酸枣仁采收期的确定及其质量控制提供依据。

1 仪器与试药

安捷伦1100高效液相色谱仪（美国Aglient科技有限公司），Sartorius BP-211D电子分析天平（德国赛多利斯公司），SK6200H超声仪（上海科导超声仪器有限公司），Milli Q Academic纯水仪（密理博科技有限公司），HH-6数显恒温水浴锅（常州国华仪器制造有限公司）。

6’’’-阿魏酰斯皮诺素（批号190803-084，纯度≥98%），南京森贝伽生物科技有限公司；斯皮诺素（批号111869-201704），中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯），美国TEDIA有限公司；超纯水（自制），其余试剂均为分析纯。

酸枣仁样品为2020年8－10月采自山东临沂的同一片酸枣林的10棵酸枣树（每棵树采样约100 g，总采样量约1 kg/次），去除果肉及核壳后干燥而成，经江苏省中医院主任中药师朱育凤鉴定为鼠李科植物酸枣Mill. var.（Bunge）Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子。采集信息见表1。

表1 酸枣仁药材样品采集信息

编号采收日期编号采收日期 S12020-08-25 S62020-09-19 S22020-08-30 S72020-09-24 S32020-09-04 S82020-09-29 S42020-09-09 S92020-10-04 S52020-09-14 S102020-10-09

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液

精密称取斯皮诺素、6’’’-阿魏酰斯皮诺素对照品适量，分别加70%乙醇溶解，制成斯皮诺素、6’’’-阿魏酰斯皮诺素对照品贮备液。取上述对照品贮备液适量，加70%乙醇制成斯皮诺素、6’’’-阿魏酰斯皮诺素浓度分别为34.02、27.14 µg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

精密称取酸枣仁粉末（过4号筛）约1.0 g，置三角烧瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，称定质量，加热回流提取30 min，放冷后用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件

采用Agilent EC-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，4 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，梯度洗脱（0～5 min，11%～14%乙腈；5～16 min，14%乙腈；16～30 min，14%～21%乙腈；30～36 min，21%乙腈；36～45 min，21%～23%乙腈；45～60 min，23%～80%乙腈；60～75 min，80%乙腈），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长312 nm。混合对照品及代表性样品（S9）色谱图见图1。

注：A.混合对照品；B.供试品；1.斯皮诺素；2. 6’’’-阿魏酰斯皮诺素

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

精密吸取供试品溶液（S9），按“2.2”项下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图。以保留时间、峰面积均适中且分离度较好的6’’’-阿魏酰斯皮诺素为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD＜0.5%，相对峰面积RSD＜3.4%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取酸枣仁样品（S9），按“2.1.2”项下方法重复制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件检测，记录色谱图。以保留时间、峰面积均适中且分离度较好的6’’’-阿魏酰斯皮诺素为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD＜0.5%，相对峰面积RSD＜3.8%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

精密吸取供试品溶液（S9），分别于0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”项下色谱条件检测，记录色谱图。以保留时间、峰面积均适中且分离度较好的6’’’-阿魏酰斯皮诺素为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD＜0.5%，相对峰面积RSD＜3.8%，表明供试液溶液在24 h内稳定。

2.4 指纹图谱建立及相似度评价

2.4.1 指纹图谱及色谱峰确认

取10批样品粉末，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件检测，记录色谱图。将10批样品HPLC图谱积分处理后，以AIA格式导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以S1作为参照图谱，选择平均数作为对照指纹图谱生成方法，时间窗口宽度设置为0.1，运用多点校正的方法对色谱峰进行全谱匹配，并生成对照图谱，见图2。

注：A.样品指纹图谱；B.对照图谱

10批酸枣仁样品指纹图谱中共标记出14个共有峰。通过与对照品图谱比对，确认2个色谱峰，分别为4号峰斯皮诺素、9号峰6’’’-阿魏酰斯皮诺素，峰面积和约占共有峰峰面积的60%，其中9号峰峰形好、响应值高、分离度好，作为参照峰。以9号峰为参照峰，计算14个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果发现，14个共有峰的相对保留时间RSD＜1.0%，表明方法的重复性较好；相对峰面积RSD为12.3%～40.6%，表明不同采收期酸枣仁中的化学成分含量存在较大差异。

2.4.2 相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对酸枣仁样品指纹图谱进行相似度分析，结果显示，10批样品指纹图谱与对照图谱的相似度为0.940～0.999，批间相似度为0.906～1.000，采收期相差越大其相似度越小。10批酸枣仁样品指纹图谱14个共有峰峰面积见表2，相似度评价结果见表3。

2.5 化学模式识别分析

2.5.1 聚类分析

以10批酸枣仁样品指纹图谱共有峰的峰面积为变量，采用SPSS23.0统计软件进行聚类分析。采用瓦尔德法，Z标准化后以平方欧式距离进行区间测量，结果见图3。结果表明，当平方欧式距离为10时，酸枣仁样品可分为两类，S1～S3聚为一类，S4～S10聚为一类。

表2 酸枣仁HPLC指纹图谱14个共有峰在10批样品的峰面积

编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10 146.99179.46249.25384.22292.75386.53420.73444.29432.91424.94 255.9160.1853.6378.5463.82143.2084.40151.74115.11115.37 3117.1780.3098.68103.36108.26119.50127.07149.69146.39143.52 4443.44597.52704.77830.42872.53898.04974.291 028.711 024.541 007.22 523.7719.2117.6927.4527.2234.0732.8130.4531.5430.58 615.8016.6213.4521.4218.0419.2119.0017.6116.9017.10 737.8728.5523.4645.1940.1542.8141.3332.5937.7536.06 822.7124.0532.2842.2435.0637.4340.8843.4843.0541.96 9543.71470.69591.23705.77719.22771.09722.03666.88637.73628.76 1036.7165.5299.5287.53112.66115.18117.49117.72105.74103.67 1132.2457.31100.0892.32112.83118.29122.46123.54106.00103.64 1222.3553.3065.3993.58107.27116.56112.10115.2295.3693.79 1326.6666.9386.08120.45135.41146.11141.76145.11121.20118.75 1417.7010.0814.3710.3713.7115.3915.4514.9113.9113.88

表3 10批酸枣仁样品指纹图谱相似度评价结果

编号S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10 S11.000 S20.9571.000 S30.9450.9961.000 S40.9390.9900.9921.000 S50.9520.9950.9970.9961.000 S60.9420.9900.9910.9980.9961.000 S70.9250.9890.9940.9970.9950.9961.000 S80.9060.9840.9900.9900.9870.9910.9971.000 S90.9060.9860.9910.9890.9870.9880.9960.9981.000 S100.9070.9860.9910.990.9870.9880.9960.9981.0001.000 R0.9400.9950.9970.9970.9980.9970.9990.9950.9950.995

图3 10批酸枣仁样品指纹图谱聚类分析树状图

2.5.2 主成分分析

将10批不同采收期酸枣仁样品指纹图谱共有峰的峰面积作为变量，导入SPSS23.0统计软件，进行PCA建模，通过降维处理后所获得的主成分能反映酸枣仁指纹图谱中14个共有峰的主要信息。成分载荷矩阵可说明各变量对主成分的贡献率，载荷的绝对值越大其对主成分的贡献越大。前3个主成分载荷矩阵见表4。主成分1信息量最大，贡献率为65.935%，其中，峰12、13、4、1载荷值较大。主成分2的贡献率为12.920%，峰6、7、14、3载荷值较大。主成分3的贡献率为11.700%，峰14、7、5、3载荷值较大。表明多种化学成分共同引起酸枣仁的质量差异。

表4 酸枣仁样品指纹图谱PCA主成分载荷矩阵

峰号主成分1主成分2主成分3 10.9480.073-0.199 20.7650.2760.197 30.6570.4910.449 40.9500.181-0.146 50.869-0.0810.443 60.589-0.7700.120 70.508-0.6710.519 80.9290.055-0.100 90.848-0.2600.153 100.8870.202-0.320 110.9090.176-0.278 120.964-0.055-0.182 130.962-0.053-0.207 140.0490.5050.754 特征值9.2311.8091.638 贡献率/%65.93512.92011.700 累积贡献率/%65.93578.85590.555

2.5.3 正交偏最小二乘-判别分析

为研究不同采收期酸枣仁化学成分差异，参考相关文献[13-14]，以聚类分析得到的两类酸枣仁样品（S1～S3、S4～S10）为研究对象，以共有峰峰面积为变量，导入SIMCA14.1软件进行有监督模式的OPLS-DA，获得相应模型，见图4A。结果表明，累积解释能力参数（R2X）为0.982，累积解释能力参数（R2Y）为0.994，预测能力参数（Q2）为0.934，均大于0.5，表明该模型稳定可靠、预测能力强，可用于区分不同采收期样品。由OPLS-DA得分图可知，早期采收的酸枣仁样品（S1～S3）与中后期样品（S4～S10）化学成分含量存在差异。

对建立的OPLS-DA模型进行100次的置换检验，结果见图4B。图中，最右侧R2、Q2值均大于0.9，高于左侧的R2、Q2值，且Q2回归线的截距为负值，表明构建的OPLS-DA模型预测能力较好，未出现过拟合，可用于不同采收期酸枣仁样品的判别分析。

为筛选不同采收期样品的主要标志成分，在OPLS-DA模型中计算变量重要性投影（VIP），并对14个共有峰峰面积VIP值进行排列，结果见图4C。以VIP＞1.0为标准，对差异标志物进行筛选，共得到3个共有峰，分别为4号峰（斯皮诺素，VIP＝2.207）、1号峰（VIP＝1.770）、9号峰（6’’’-阿魏酰斯皮诺素，VIP＝1.400）。这些化学成分对不同采收期酸枣仁样品分类具有显著影响，是区分酸枣仁成熟与否的主要标志性成分。

注：A.得分图；B.模型置换检验；C. VIP图

3 讨论

本试验对酸枣仁样品进行了全波长扫描，对各波长的指纹图谱进行比较，发现在312 nm波长处色谱峰响应较高，峰数目较多，峰形对称，各色谱峰分离度较好，基线较平稳。因此，确定检测波长为312 nm。

空白试验结果显示，提取溶剂（70%乙醇）及流动相对酸枣仁指纹图谱的检测无干扰；指纹图谱完整性考察过程中，将指纹图谱采集时间延长至120 min，以确定谱图采集的完整性，结果发现64 min后无色谱峰出现，因此确定指纹图谱的采集时间为75 min。前期试验比较了水、甲醇及70%乙醇的提取效果，发现水提样品指纹峰的数目较甲醇及75%乙醇提取样品少，为获得更多的指纹峰，同时参考2020年版《中华人民共和国药典》[1]及相关文献[10-11]，选择70%乙醇作为酸枣仁供试品提取溶剂。

由于中药材的特殊性，不同产地酸枣仁指纹图谱会有一定的差异。为排除产地干扰，本试验所用酸枣仁药材采自同一地区同一片酸枣林，具有一定的可比性。本研究采用HPLC建立不同采收期酸枣仁指纹图谱，10批酸枣仁样品指纹图谱中共标记出14个共有峰。OPLS-DA发现，所收集的酸枣仁样品可分为早期和中后期两类，与聚类分析结果一致。

通过OPLS-DA进行差异性标志物的筛选，共得到3个差异性标志物峰，分别为4号峰（斯皮诺素）、1号峰（未知成分）、9号峰（6’’’-阿魏酰斯皮诺素），这些化学成分对不同采收期酸枣仁样品分类有显著影响，是区分酸枣仁成熟与否的主要标志性成分。2020年版《中华人民共和国药典》酸枣仁的指标性成分之一为斯皮诺素，故以斯皮诺素作为质量控制指标具有合理性。此外，未知成分的定性尚待进一步研究。

果实种子类药材多在自然成熟时采收[15]，药材质量受采收时间影响较大。对不同采收期酸枣仁样品指纹图谱14个共有峰不同识别模式的数据分析发现，酸枣仁成熟早期化学成分积累迅速，化学成分差异较大，中后期即达到平衡状态，某些成分甚至出现降低趋势。因此，过早抢收对酸枣仁品质有明显影响，而中后期采摘则影响较小。以山东临沂产酸枣为例，其采收期应在九月中旬以后。

本试验通过HPLC指纹图谱结合化学模式识别方法揭示了不同采收期酸枣仁化学成分的差异及变化，可为酸枣仁采收期的确定及其质量控制提供依据。

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Comparative Study on Quality of Ziziphi Spinosae Semen in Different Harvest Periods Based on HPLC Fingerprints Combined with Chemical Pattern Recognition

ZHOU Hongliang1, WENG Yan1, SHAO Yilin2, HUANG Yawei1

To establish the analytical method of HPLC fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods; To compare the differences in the fingerprint peaks of the chemical constituents of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods through the dynamic changes of fingerprints and chemical pattern recognition methods; To look for differential markers; To provide a basis for the determination of the best harvest time of Ziziphi Spinosae Semen.HPLC method was established on Agilent EC-C18 column (150 mm × 4.6 mm,4 μm) with acetonitrile- 0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min; chromatogram fingerprints was established at 312 nm. Fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen in different harvest periods were collected to evaluate the similarity. Cluster analysis, principal component analysis and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were used to conduct chemical pattern recognition research on samples.The analytical method of HPLC fingerprints of Ziziphi Spinosae Semen were established. A total of 14 common peaks were identified, and 2 components were identified, namely spinosine (peak No. 4) and 6’’’-feruloyl spinosine (peak No. 9). The range of similarity of samples in different harvest periods was 0.906–1.000. The samples could be distinguished by different chemical pattern recognition methods. Spinosine and other three components may be differential markers that affect the quality of Ziziphi Spinosae Semen by OPLS-DA.The iconic components that affect the quality of Ziziphi Spinosae Semen can be preferably identified by HPLC fingerprints and chemical pattern recognition methods. This research can provide a reference for the best harvest period and quality control of Ziziphi Spinosae Semen.

Ziziphi Spinosae Semen; harvest periods; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discrimination analysis; differential markers; quality control

R284.1

1005-5304(2021)12-0068-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202105217