壳聚糖镓配合物的制备及抗菌性能研究*

2021-12-14赵明源戚晓宇马红艳

功能材料 2021年11期

付豪，万强，赵明源，戚晓宇，马红艳

(天津科技大学化工与材料学院，天津 300457)

0 引言

抗生素自问世以来，就迅速成为对抗细菌感染的首选药物。然而几十年来，人们对抗生素的不合理和过度使用，使得细菌的耐药性正在以惊人的速度增长[1]。出现了许多多重耐药细菌菌株(MDR)，其中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)、抗万古霉素肠球菌(VRE)和多重抗药性结核杆菌(MDR-TB)等“超级细菌”菌株已成为目前抗菌剂的主要挑战[2]。针对这一现状，传统的抗生素已经不能满足抗菌需求，研究者们将目光转移至具有长效性、广谱抗菌性的无机抗菌剂[3]。

目前，壳聚糖(CS)作为一种天然、安全、无毒的抗菌防腐剂，在服装、食品和生物医药等领域具有广泛的应用前景[4-6]。然而，壳聚糖本身抗菌能力较弱，因此提高CS的抗菌能力及抗菌持效性是亟待解决的关键问题。当前提高CS抗菌能力常用的策略之一是向CS材料中添加外源抗菌金属添加物，如Ag、Cu、Zn、Ti以及一些金属氧化物，以提高CS复合材料的抗菌能力[7]。金属Ga3+由于其离子半径，电离势和电子亲和力与Fe3+很相似，可以代替Fe3+与铁转运蛋白形成复合物并将其传递到细胞中[8]，但Ga3+并不能与Fe3+一样参与氧化还原反应[9]，这使得镓可以通过铁载体进入细菌细胞来抑制细菌生长。正是镓这种独特的抗菌机制，使它成为潜在的有效抗菌剂，用来治疗抗生素耐药菌引起的感染[10]。

然而，单一Ga3+的抗菌活性较低，需要与载体结合来提高其抗菌活性，同时CS氨基基团上的氮原子具有的孤对电子使得壳聚糖具有极好的金属络合能力。综上，为了提高壳聚糖和Ga3+的抗菌活性，本研究用CS作为载体与Ga3+结合，获得壳聚糖镓配合物(CS-Ga)。这种配合物结合了壳聚糖与镓的诸多优点，壳聚糖与Ga3+发挥协同抗菌作用，显示出优异的抗菌效果；壳聚糖又可以充当药物缓释载体，为镓类化合物在抗菌方面的应用提供更广阔的前景。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

壳聚糖(脱乙酰度≥90%)，北京索莱宝科技有限公司；无水氯化镓(99.999%)阿拉丁试剂(上海)有限公司；无水乙醇(分析纯)，天津市汇杭化工科技有限公司；盐酸(分析纯)，天津市风船化学试剂科技有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器(江苏中大仪器科技有限公司)；ZF-6050型真空干燥箱(巩义市宏华仪器设备工贸有限公司)；WPL-65BE型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；YA28X-4T/10Ⅱ型高压蒸汽灭菌锅(宁波永兴医疗器械公司)；Varion EL CUBE元素分析仪(德国元素分析系统公司)；Thermo iCAP65型电感耦合等离子发射光谱仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖镓复合物的制备

称取2 g烘干后的壳聚糖粉末，溶于200 mL 0.5%的盐酸溶液中，在60 ℃下搅拌6 h。加入6 mL 1 mol/L的氯化镓溶液，将混合溶液在55 ℃水浴锅中反应24 h后取出冷却至室温，调节pH至6.5，加入3倍体积无水乙醇，静置过夜，将沉淀反复抽滤并用无水乙醇洗涤数次，然后置于60 ℃下真空干燥至恒重。

1.2.2 粘均分子量的测定

配制0.2 mol/L NaCl-0.1 mol/L醋酸混合溶剂。准确称取0.05 g干燥后的CS-Ga，溶解于混合溶剂中，定容至50.0 mL。粘度测定时控制水浴槽温度在(25±0.1)℃内，用移液管量取10.0 mL溶液至粘度计内，恒温20 min后测量流出时间t。用稀释法配制不同浓度梯度的壳聚糖溶液，并测量溶液流出的时间。溶液的特性粘度ηsp=ηr-1=(t-t0)/t0，式中，t为溶液流出的时间，t0为溶剂流出时间。

根据Huggins公式ηsp/C=[η]+k[η]2C可以求出聚合物的极限粘数[η]。将ηsp/C对浓度C作图，外推至C为0处，截距即为极限粘数[η]。再根据 Mark-Houwink公式[η]=KMα可计算出粘均分子量M，对于给定的聚合物，式中K、α为常数，本实验条件下，采用K=1.81×10-3，α=0.93[11]。

1.2.3 元素分析

使用元素分析仪和电感耦合等离子发射光谱仪进行分析，功率1 150 W，泵转速50 r/min，辅助气体流0.50 L/min，雾化器气流0.55 L/min，冷空气流12.00 L/min对样品的各元素含量进行测定；

1.2.4 扫描电子显微镜分析

取少量干燥24 h后的样品粘在导电胶上，用洗耳球吹掉导电胶表面粘固不牢的颗粒，然后对其进行喷金处理，扫描电压20 kV，用JSM-6380LV型扫描电子显微镜对其进行观察。

1.2.5 红外光谱表征

将制备好的样品干燥24 h以后用玛瑙研钵研磨成细粉，再取1 mg与干燥后的溴化钾粉末研磨混合均匀，用小药勺将粉末转移至模具中压制成片，采用布鲁克品牌的TENSOR 27型号的红外光谱仪器进行检测。

1.2.6 X射线衍射分析

对制备好的样品进行X射线衍射检测。测试条件为：管压40 kV，强度50 mA，扫描范围为5～60°，扫描步长2θ为0.02°/step，扫描速度为1 s/step。

1.2.7 差示扫描量热分析

对样品进行差示扫描量热测定。测试方法如下：取10 mg样品放入铝杯并密封，以氧化铝为对照，在氮气环境下，以10 ℃/min的速度从40 ℃升温到700 ℃。

1.2.8 最低抑菌浓度检测

将大肠杆菌(E.coli)与金黄色葡萄球菌(S.aureus)在营养琼脂培养基平板上划线于37 ℃下培养24 h后，分别挑取单一菌落接种至50 mL液体LB培养基中活化，再将活化后的菌液用PBS缓冲液稀释至105CFU/mL备用。

称取CS和CS-Ga分别加入10 mL液体LB培养基中，使得培养基中的药品终浓度分别为0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22 mg/mL，对照为不加药的空白培养基。将已备好的菌悬液取50 μL分别加入培养基中，每组相同的药品浓度准备3个平行样品。E.coli在37 ℃培养24 h，S.aureus在37 ℃培养48 h。培养结束后，取菌悬液稀释到106CFU/mL后，分别取100 μL在平板中涂布分别于37 ℃下培养24和48 h后，统计平板上生长的菌落数，得到CS和CS-Ga的最低抑菌浓度(MIC)。

1.2.9 不同作用时间对CS-Ga抑菌性能的影响

准确称取50.0 mg的CS和CS-Ga粉末分别倒入试管中，加入50 mL磷酸盐缓冲液 (PBS)溶解，并超声分散30 s后，对照为空白添加。溶解好的药品须经直径0.22 μM孔径的滤菌器过滤才可使用。取10 mL的滤液加入按1.2.8中步骤准备的105CFU/mL的菌悬液50 μL，振荡混匀10 s，分别静置10、30、60 min，每组相同条件的实验准备3个平行样品，用移液枪分别取0.5 mL混合菌悬液加入到含有4.5 mL无菌的磷酸盐缓冲液的试管中，重复操作，连续稀释102、103、104、105倍后，用移液枪分别取3 μL的菌液滴在10 g/L的LB固体培养基上，倒置放在37 ℃下恒温培养箱中静止培养48 h后，观察记录结果。

2 结果与讨论

2.1 粘均分子量的测定

利用乌氏粘度计测量CS和CS-Ga的粘均分子量，得到两者的比浓度与浓度的关系如图1所示。在同一溶剂，同一温度下，利用Huggins方程外推计算得到的[η]可以直观地表现二者分子量的差距。

图1 CS和CS-Ga的ηsp/C-C关系图Fig 1 ηsp/C-C diagram of CS and CS-Ga

由表1可以得出，CS的粘均分子量为1.23×106，CS-Ga的粘均分子量为1.712×104，这是因为在反应过程中，分子的长链结构被破坏变成短链，导致CS的特性粘度和粘均分子量都大大降低。

表1 CS和CS-Ga粘均分子量的测定结果

2.2 元素分析

分别对CS和CS-Ga进行有机元素分析及ICP元素分析，其结果见表2。数据表明，CS-Ga与CS的碳氮比相等且与理论值接近，说明壳聚糖单体结构没有改变；样品中镓的含量占比达到13.30%，推测壳聚糖单体和镓的配比约为3∶1。

表2 CS和CS-Ga中各元素的比例Table 2 The proportion of each element of CS and CS-Ga

图2 CS(a)和CS-Ga(b)的扫描电镜图Fig 2 SEM of CS and CS-Ga

从图中观察得，CS与CS-Ga均呈分散均匀的颗粒状物质，CS粒径介于20～100 μm之间，颗粒呈片状；CS-Ga的粒径介于10～30 μm之间，与CS相比，颗粒较小，并且分布均匀。这与2.1节结果吻合，CS-Ga的颗粒较小，粘均分子量较低。

2.3 红外光谱分析

3 480 cm-1附近是O—H伸缩振动造成的吸收峰，3 264 cm-1左右的吸收峰属于N-H伸缩振动[12]。图1显示在壳聚糖镓配合物中3 300 cm-1左右的吸收峰由3 361.18 cm-1移至3 352.28 cm-1，并且峰形变得更宽，说明镓的加入使得N-H键伸缩作用减弱，N-M键加强[13]。壳聚糖中的1 659.02 cm-1为酰胺Ⅰ谱带(C=O)、1 597.10 cm-1为酰胺Ⅱ谱带(N-H)，而在壳聚糖镓配合物中，酰胺Ⅱ谱带消失，可能是壳聚糖的氨基发生了配位。1 423.96 cm-1是壳聚糖的CH2弯曲振动和CH3变形振动吸收峰，该峰在壳聚糖镓配合物中变宽，吸收变弱，说明壳聚糖的分子内和分子间氢键形成方式发生变化。壳聚糖上的二级醇羟基的特征吸收峰也由1 077.50 cm-1移至1 075.11 cm-1，说明了壳聚糖的二级醇羟基可能也参与了配位。

图3 CS(a)和CS-Ga(b)的FT-IR曲线Fig 3 FT-IR spectra of CS and CS-Ga

2.4 结晶性分析

壳聚糖是低结晶性高分子，在研究的2θ角度范围内，壳聚糖的主要结晶峰在10.15°、15.3°、19.95°等处。而在CS-Ga的衍射图中，晶体反射角出现在12°和26°，同时，峰形变得更宽更矮。以上结果说明壳聚糖在结合了镓离子之后，晶体结构被进一步破坏，耦合效应阻碍了分子内氢键的形成，使分子内的单元排列从有序变为无序，结晶度降低。

图4 CS(a)和CS-Ga(b)的X射线衍射图Fig 4 X-ray diffraction patterns of CS and CS-Ga

2.5 热稳定性分析

由图5(a)的TG-DTG曲线可以看出，壳聚糖的热分解分为两个阶段：第一个阶段为25～100 ℃，样品失重10.47%，主要原因是脱去了样品所带的水分；第二个阶段为220～360 ℃之间，壳聚糖失重39.48%，在292.86 ℃时，壳聚糖的热分解速率达到最大。在整个过程中，壳聚糖的总失重量为64.86%。由图5(b)的TG-DTG曲线可以看出，壳聚糖镓配合物的热分解也分为两个阶段：第一个阶段为25～160 ℃，壳聚糖镓配合物失重9.27%，主要原因是脱去样品所带的水分；第二个阶段为200～400 ℃，壳聚糖镓配合物失重31.28%，在273.50 ℃时，壳聚糖镓配合物的热分解速率达到最大。在整个过程中，壳聚糖镓配合物的总失重量为50.72%。与壳聚糖相比，壳聚糖镓配合物由于结合了镓离子，其分子内的氢键结构发生改变，结晶度降低，热稳定性减小，这一结果与文献报道一致[13-14]。

图5 CS(a)和CS-Ga(b)的TG和DTG曲线Fig 5 TG-DTG curves of CS and CS-Ga

2.6 最低抑菌浓度检测

由图6、7可以看出，在0.1～0.22 mg/mL的浓度范围内，三者对于E.coli与S.aureus的抗菌效果均随着浓度的增大而增加。其中，在此浓度范围内，氯化镓对E.coli与S.aureus的抗菌效果均不太显著，壳聚糖镓金属配合物的抗菌效果最为明显。对于E.coli，壳聚糖镓配合物的最低抑菌浓度为0.18 mg/mL，低于壳聚糖的最低抑菌浓度0.22 mg/mL；对于S.aureus，壳聚糖镓配合物的最低抑菌浓度为0.16 mg/mL，低于壳聚糖的最低抑菌浓度0.18 mg/mL。以上结果表明，壳聚糖在结合了镓离子之后，抗菌活性得到了提升，这个结果与多个文献所报道的壳聚糖金属配合物的抗菌性高于壳聚糖的抗菌结果一致[15-18]。

图6 不同浓度的CS，GaCl3和CS-Ga对大肠杆菌的抑菌效果Fig 6 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on E. coli

图7 不同浓度的CS，GaCl3和CS-Ga对金黄色葡萄球菌的抑菌效果Fig 7 Antibacterial effect of different concentrations of CS, GaCl3 and CS-Ga on S. aureus

2.7 不同作用时间对CS-Ga抑菌性能的影响

由于CS-Ga对E.coli的抗菌性与壳聚糖的差异不大，所以研究了CS和CS-Ga分别与S.aureus接触不同时间后对其活性的影响。图8(D～F)是壳聚糖与S.aureus混合培养10、30、60 min后，在胰蛋白酶琼脂板接种培养后的数码照片; 图8(G～I)是壳聚糖镓配合物与S.aureus混合培养10、30、60 min后，在胰蛋白酶琼脂板接种培养后的数码照片；图8(A～C)为空白对照。培养皿上的1、2、3、4分别代表不同的稀释倍数下接种细菌生长情况。壳聚糖由于其分子链上有氨基的存在，具有一定的抑菌杀菌性能。在结合了镓离子后，镓离子可以进入细胞从而影响细菌的铁代谢途径，抑制细菌正常的代谢活动。壳聚糖与镓离子发挥协同抗菌的作用，使得壳聚糖镓配合物的抗菌性提高。CS-Ga与细菌作用10 min时，便发挥了作用，作用60 min后，CS-Ga便可完全抑制S.aureus的生长。图8中菌落生长情况很直观地显示了CS-Ga对S.aureus具有优异的抗菌性。