急性髓系白血病患者WT1基因表达水平及其在微小残留病灶监测中的临床意义

宁 可，王海峰，徐 莉，李丽宁

(1.西北大学附属医院 西安市第三医院检验科，陕西 西安 710018；2.空军军医大学西京医院血液内科，陕西 西安 710032)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种常见的血液系统肿瘤，约占成人急性白血病的60%～70%[1]。尽管化疗方案不断完善和各种新药相继出现，AML患者无病生存率和总生存时间也不断提高，但是疾病复发仍是治疗失败、影响患者长期生存的主要原因。白血病患者复发的根本原因是体内微小残留病灶(Minimal residual disease，MRD)的存在，患者能否长期生存与其关系密切，因此监测MRD对于AML患者疗效评估、预后指导和个体化治疗具有重要意义。实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)因灵敏度高、特异性强，可以用来检测AML特定融合基因，已经成为临床上监测MRD的常用手段[2-3]，但是超过50%的AML患者无特异性分子生物学标志，治疗后无法用RQ-PCR监测MRD。为了寻找基因中AML的预后指标，进而连续监测和动态观察AML患者的病情变化，国内外许多学者开始研究WT1基因。最早WT1基因是从儿童肾脏肾母细胞瘤中分离出来的肿瘤抑癌基因，位于11p13，由10个外显子组成，长度约50 kb。研究[4-6]发现，WT1基因是调控造血细胞增殖和分化的转录抑制剂，可能在恶性血液系统疾病的发生中起重要作用，尤其在大部分AML呈高表达，而在正常骨髓中少量表达或者不表达。因此，WT1基因较早地被认为是“泛白血病”基因标志，很有希望成为无特异融合基因标记的AML患者MRD监测靶点[7-11]。本研究采用RQ-PCR技术检测AML患者体内WT1基因的表达情况，分析WT1与AML分型及临床病程之间的关系，探讨其作为MRD监测AML预后的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月至2018年12月空军军医大学西京医院血液内科收治的初发AML患者59例(AML组)，其中男性37例，女性22例；年龄15～69岁，中位年龄49岁。所有患者的诊断均符合FAB分型和WHO 2016年血液系统肿瘤诊断标准，经骨髓形态学、免疫学、细胞遗传学及分子生物学检测等确诊。另选取同时期就诊的骨髓分类正常的16例患者作为对照组，其中男性11例，女性5例；年龄23～65岁，中位年龄44岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。所有患者均未发现其他恶性肿瘤或传染性疾病。

1.2 基因表达水平检测 取EDTA-Na2抗凝的患者骨髓标本4 ml，加入红细胞裂解液裂解红细胞后，2000 r/min离心5 min，得到白细胞沉淀，然后用TRIzol法提取细胞总RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水混匀溶解。以此RNA作为PCR反应模板，使用美国安捷伦公司的荧光定量RCR仪(Mx 3000p)检测AML患者各阶段WT1基因及相关基因(AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11)mRNA表达水平，内参基因选用ABL(所有基因定量检测试剂盒均购自上海源奇生物技术有限公司，批号分别是AML-ETO基因(CA100008)、PML-RARa基因(CA100012)、CBFβ-MYH11基因(CA110010)、WT1基因(CA000022))。同时检测各基因标准品和患者样本。每次实验均以ABL基因作为阳性对照，各基因的阴性标本作为阴性对照，保证实验结果的真实有效可靠。基因表达水平计算：目的基因拷贝数/ABL拷贝数×100%。

1.3 细胞遗传学检查 培养患者初发时骨髓细胞，24 h后加入秋水酰胺使分裂细胞停止在分裂中期，制备染色体标本，应用G显带技术，在油镜下分析20个分裂中期细胞。根据《国际人类细胞遗传学命名法(ISCN)2005》描述异常核型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 12.0统计学软件进行分析。WT1及相关基因表达水平以M(P0，P100)表示，组间比较采用秩和检验。各基因间相关性分析采用Pearson法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者WT1基因表达水平比较 对照组骨髓WT1基因表达水平为0.21%(0%，0.53%)，AML组骨髓WT1基因表达水平为43.32%(0.56%，98.06%)，AML组WT1基因表达水平显著高于对照组(P<0.01)。结合临床经验和文献资料，将WT1阈值设为WT1 mRNA≥0.60%[2]。

2.2 不同临床特征AML患者WT1基因表达水平比较 见表1。不同年龄、性别及白细胞计数AML患者WT1基因表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。FAB分型中，M3与M4型患者WT1基因表达水平较高，但两者比较差异无统计学意义(P>0.05)；与M2型患者比较，M3型患者WT1基因表达水平较高，M5型患者WT1基因表达水平较低(均P<0.05)；M5型患者WT1基因表达水平亦低于M4型患者(P<0.05)。

表1 不同临床特征AML患者WT1基因表达水平比较(%)

2.3 不同核型AML患者WT1基因表达水平比较 见表2。异常核型检出率为64.4%(38/59)，异常核型患者WT1基因表达水平高于正常核型患者(P<0.05)。在38例异常核型AML患者中，核型包括复杂核型、t(8；21)/AML1-ETO、t(15；17)/PML-RARa、t(16；16)/CBFβ-MYH11四种类型。t(15；17)/PML-RARa和t(16；16)/CBFβ-MYH11患者WT1基因表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。复杂核型和t(8；21)/AML1-ETO患者WT1基因表达水平低于t(15；17)/PML-RARa患者(均P<0.05)。

表2 不同核型AML患者WT1基因表达水平比较(%)

2.4 AML患者WT1与AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因表达水平相关性分析 急性早幼粒细胞白血病(APL)是AML的一种特殊亚型，靶向药物全反式维甲酸、三氧化二砷联合常规化疗使得APL成为可被治愈的急性白血病，因此本研究仅将AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因作为研究对象。将11例AML伴AML1-ETO患者治疗前后标本51份与3例AML伴CBFβ-MYH11患者治疗前后标本10份进行RQ-PCR。病例跟踪结果包括持续缓解和血液学复发两种情况。AML1-ETO阳性患者中，持续缓解的6例患者30份标本AML1-ETO与WT1基因表达水平呈正相关(r=0.76，P<0.05)；4例血液学复发患者治疗前后15份标本WT1与AML1-ETO基因表达水平呈正相关(r=0.81，P<0.05)；而有1例血液学复发患者6份标本AML1-ETO升高而WT1基因未升高，仍在初始表达水平(1.27%)附近浮动，且两者没有相关性。CBFβ-MYH11阳性患者中，CBFβ-MYH11与WT1基因表达水平呈正相关(r=0.74，P<0.05)。

3 讨 论

AML是一种高度异质性疾病，不同FAB亚型有不同的治疗效果，即使相同亚型也可能出现截然不同的疾病转归，因此监测MRD对于识别高危患者、了解疾病缓解程度和预测早期复发具有十分重要的意义。MRD定期监测及评估是白血病治疗过程中的重要一环。荧光原位杂交、流式细胞术和RQ-PCR都可以进行MRD检测，但目前RQ-PCR是敏感度较高的一项技术，可以达到103～105，在临床上通常作为诊断和监测MRD的金标准[3，12]。但是急性白血病分型较多，拥有特异性融合基因的相对有限，除了部分含有AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11等融合基因外，仍有50%～60%患者并不表现出特异性的分子生物学及细胞遗传学异常[13]，这些患者治疗效果的评价及治疗后MRD的监测相对比较困难，因此寻找新的分子靶点变得尤为重要。研究[6，13-17]发现，WT1几乎在所有的白血病中都有表达，尤其在超过70%的AML中高表达，被认为是一种潜在的血液学肿瘤MRD标志物，并且有望用于疾病诊断、预后判断及MRD监测。

本研究通过比较不同临床特征AML患者WT1基因表达水平发现，WT1基因表达水平高低与AML患者初发时的年龄、性别以及发病时的白细胞计数没有明显相关性。关于AML各亚型之间WT1基因表达水平的高低，目前普遍认为M3型患者WT1基因表达水平最高，M5型表达水平最低[18-20]。本研究结果显示，M3与M4型患者WT1基因表达水平较高，但两者比较差异无统计学意义；与M2型患者比较，M3型患者WT1基因表达水平较高，M5型患者WT1基因表达水平较低；M5型患者WT1基因表达水平亦低于M4型患者。也有学者认为各亚型WT1基因表达水平比较都无统计学差异，各家统计结果之间不一致的原因可能是样本量不够大，也有可能是在AML诊断方面存在偏差。与此同时，异常核型患者WT1基因表达水平高于正常核型患者；t(15；17)和t(16；16)核型AML患者WT1基因表达水平比较差异无统计学意义；复杂核型和t(8；21)患者WT1基因表达水平低于t(15；17)患者。

我们跟踪观察了11例 AML1-ETO阳性AML患者51份标本和3例CBFβ-MYH11阳性AML患者10份标本WT1及AML1-ETO、CBFβ-MYH11融合基因表达水平的变化，发现除1例AML1-ETO复发患者AML1-ETO水平显著升高，WT1表达水平始终在初始水平附近，没有提示复发外，其他病例WT1变化情况均与疾病发展呈正相关。因为这例患者初诊时WT1基因呈低水平表达(WT1基因初始表达水平1.27%)，能否将低水平表达的WT1基因作为监测MRD的指标还需要大量的样本验证。本研究通过比较完全缓解和复发AML患者WT1基因表达水平变化情况也进一步证实，对那些无特异性分子生物学标志的急性白血病来说，WT1基因可以作为白血病细胞的特异性标志监测MRD[6-7，21-22]。

综上所述，采用RQ-PCR检测WT1基因表达水平，可以监测AML患者MRD、评估治疗效果、预后以及预测疾病复发风险。