右美托咪定对坐骨神经慢性压迫损伤模型大鼠神经病理性疼痛的缓解作用及机制研究

王 瑗，冯建梅，卫白杨

(空军军医大学唐都医院麻醉科，陕西 西安 710038)

神经病理性疼痛指由于躯体感觉神经系统受到损伤或者出现疾病而导致的疼痛，临床主要表现为自发性疼痛、痛觉过敏、异常疼痛以及感觉异常等。据统计，慢性神经病理性疼痛的发病率大约占到各种慢性疼痛的30%以上，是常见且难治的疾病之一[1]。高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1，HMGB1)是一种病理性晚期的炎症介质，在慢性神经病理性疼痛的发生及发展过程中具有关键性作用[2-3]。右美托咪定是特异性α2肾上腺能受体激动药，与α2受体的亲和力为可乐定的8倍。研究[4-5]表明，右美托咪定在其他各组疾病以及慢性神经病理性疼痛治疗中表现出了良好的功效。本研究通过构建坐骨神经慢性压迫损伤(Chronic constriction injury，CCI)大鼠模型，探究右美托咪定对坐骨神经CCI模型大鼠神经病理性疼痛的缓解作用，并探讨可能的机制，以期为慢性神经病理性疼痛的治疗提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠100只，体重230～250 g，购自中国医学科学院动物所(北京华阜康生物科技有限公司)。室温饲养，相对湿度控制在(50±5)%，12 h光照与12 h黑夜交替。每天正常自由饮水、进食并保持正常活动。适应环境1周后开始实验。

1.2 主要试剂 右美托咪定(批号：20081232)购自江苏恒瑞医药有限公司；戊巴比妥钠(批号：190122)购自上海化学试剂供应站分装厂；羊抗兔一抗(批号：BA1011)、羊抗兔二抗(批号：BA1061)购自博士德生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、酶联免疫吸附(ELISA)实验试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 实验分组 将100只大鼠随机分为空白对照组、模型组、右美托咪定低剂量组(0.5 μg/kg)、右美托咪定中剂量组(1.0 μg/kg)和右美托咪定高剂量组(1.5 μg/kg)，每组10只。各组大鼠采用分笼饲养。

1.4 CCI模型构建 除空白对照组外，模型组、右美托咪定低剂量组、右美托咪定中剂量组和右美托咪定高剂量组均构建CCI模型。对大鼠的坐骨神经做结扎处理后将手术切口消毒处理，放回饲养笼内，直至大鼠逐渐复苏。在模型构建成功后的第15天，再次向大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥钠，迅速取出大脑，分离海马体，包裹于洁净的锡纸内，液氮速冻后转移至冰箱中-80 ℃保存待测。

1.5 观察指标

1.5.1 各组大鼠HMGB1蛋白相对表达量比较：采用Western blot蛋白印迹法检测各组大鼠HMGB1相对蛋白表达量。各组样品均取20 μl进行上样，用浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，然后使用PVDF膜完成转膜。转膜完成后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(羊抗兔IgG)孵育15 min，PBS清洗3次，加入二抗(羊抗鼠IgG)再次孵育15 min后曝光显影。

1.5.2 各组大鼠海马区TNF-α和IL-1β表达水平比较：按照1.5.1取蛋白样品的方法，通过ELISA法测定大鼠海马区TNF-α和IL-1β的表达水平。

1.5.3 各组大鼠海马区HMGB1及其下游Toll样受体4(TLR4)、RAGE mRNA相对表达水平比较：加入TRIzol提取大鼠海马区的RNA，将RNA反转录成cDNA，并以此为模板，通过PCR法测定HMGB1及其下游TLR4、糖基化终产物受体(RAGE)mRNA的相对表达水平。以β-actin为内参照，按照2-△△CT法处理实验数据。

2 结 果

2.1 各组大鼠HMGB1蛋白相对表达量比较 见表1。各组大鼠HMGB1蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较，模型组和各右美托咪定剂量组HMGB1蛋白相对表达量均升高，尤以模型组为著(均P<0.05)。各右美托咪定剂量组与模型组相比，HMGB1蛋白相对表达量降低(均P<0.05)。

表1 各组大鼠HMGB1蛋白相对表达量比较

2.2 各组大鼠海马区TNF-α和IL-1β表达水平比较 见表2。各组大鼠海马区TNF-α和IL-1β表达水平比较，差异有统计学意义(均P<0.05)。与空白对照组比较，模型组和各右美托咪定剂量组大鼠海马区TNF-α和IL-1β水平均升高，尤以模型组为著。各右美托咪定剂量组与模型组相比，大鼠海马区TNF-α和IL-1β水平降低，低剂量组对大鼠海马区TNF-α和IL-1β水平的降低效果显著小于中剂量组和高剂量组(均P<0.05)。右美托咪定中剂量组和右美托咪定高剂量组大鼠海马区TNF-α和IL-1β表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 各组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平比较 见表3。各组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与空白对照组比较，模型组和各右美托咪定剂量组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平均升高，尤以模型组为著。各右美托咪定剂量组与模型组相比，大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平降低，右美托咪定低剂量组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平的降低效果显著小于右美托咪定中剂量组和右美托咪定高剂量组。右美托咪定中剂量组和右美托咪定高剂量组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。

表2 各组大鼠海马区TNF-α和IL-1β表达水平比较(pg/mg)

表3 各组大鼠海马区HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA相对表达水平比较

3 讨 论

目前，有关HMGB1在炎症以及肿瘤的发生、发展中的研究较多，且近年来已经逐渐扩展到对慢性神经病理性疼痛的研究中。HMGB1在慢性神经病理性疼痛发生机制方面的研究仍然属于新领域[6-8]。

研究[9-10]发现，大脑海马区在处理慢性神经病理性疼痛信息中发挥着至关重要的作用。而慢性神经病理性疼痛患者的海马区中，炎症因子TNF-α和IL-1β的水平都表现出升高的趋势。HMGB1是重要的慢性神经病理性疼痛炎性介质。巨噬细胞、树突状细胞以及上皮细胞等在脂多糖和干扰素等因素的刺激下，会主动分泌HMGB1到细胞外，促使TNF-α和IL-1β等炎症因子的释放[11-13]。

右美托咪定自身具有高效及高选择性，是一种α2肾上腺素受体激动剂，临床证明其具有良好的镇痛作用[14]。相关动物实验[15]表明，在外周给予一定剂量的右美托咪定可以显著提高慢性神经病理性疼痛大鼠的热痛阈值。还有临床研究[16]发现，对人体进行右美托咪定全麻处理能够起到中等程度的镇痛作用。本研究结果表明，模型组大鼠HMGB1蛋白、TNF-α和IL-1β、HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA表达水平均升高，右美托咪定各剂量组HMGB1蛋白、TNF-α和IL-1β、HMGB1及其下游TLR4和RAGE mRNA表达水平均降低。在慢性神经病理性疼痛的炎症早期，HMGB1能够与其受体TLR4发生相互结合作用，激活体内的信号通路，引发炎症介质不断释放[17-18]。在细胞炎症因子的产生过程中，TLR4自身的活性会被中和，HMGB1诱导细胞因子产生的效应就会显著降低，表明TLR4是HMGB1在慢性神经病理性疼痛促炎过程中发挥作用的受体，即TLR4作为HMGB1的重要受体参与了HMGB1的信号传导过程，在慢性神经病理性疼痛细胞释放炎性因子过程中HMGB1和TLR4同时发挥出了重要作用[19-20]。

有研究发现，病理性疼痛大鼠的脊髓组织中HMGB1和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞明显增多，TLR4、肿瘤坏死因子受体相关分子6(TRAF6)、磷酸化P65(p-P65)和 髓样分化因子(MyD88)蛋白表达显著增加，即HMGB1、星形胶质细胞和TLR4/NF-κB信号通路被激活。右美托咪定治疗后，脊髓组织中HMGB1和GFAP阳性细胞数量以及TLR4、TRAF6、p-P65和MyD88蛋白表达均显著减少，表明右美托咪定能减轻神经源性大鼠的疼痛，这种作用与HMGB1、星形胶质细胞活化和TLR4/NF-κB信号通路有关。HMGB1是调节神经系统炎症反应的重要分子。在生理条件下，HMGB1与核内组蛋白结合，在维持DNA转录稳定性方面起着关键作用。经病理刺激后，可从细胞核转移到细胞质中，从而激活TLR4和核因子-κB(NF-κB)相关信号通路，并在下游炎症信号通路中释放促炎因子。周围神经损伤可导致脊髓小胶质细胞TLR4表达上调。当TLR4与相应受体结合时，可激活Toll/IL-1受体同源区，激活NF-κB相关信号通路，诱导多种炎症因子的表达，促进多种细胞因子的释放，从而激活脊髓胶质细胞的热痛觉过敏，最终引起神经性疼痛。星形胶质细胞对HMGB1敏感，因此星形胶质细胞和TLR4/NF-κB通路可能是HMGB1的重要下游调节因子。此外，右美托咪定预处理可通过抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路下调引起的炎症过程，减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，而HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路与α2肾上腺素受体的激活有关。

综上所述，右美托咪定可以减轻坐骨神经CCI模型大鼠的神经病理性疼痛，其机制可能与抑制HMGB1从而抑制星形胶质细胞活性和TLR4/NF-κB信号通路有关。