miR-489调控PI3K/Akt信号通路促进矽肺诱导小鼠肺纤维化的作用

邓丽明，周桂芳，梁博萱，梁智萍，赖丽丽，黄蕾蕾

1.广东省职业病防治院，广东 广州 510260；2.南方医院心内科，广东 广州 510515；3.南方医科大学，广东 广州 510515

矽肺是长期吸入大量游离的二氧化硅粉尘引发的肺部组织弥漫性纤维化全身性疾病，其可通过诱导肺泡巨噬细胞促进肺部炎症、细胞凋亡而促进肺组织纤维化，从而引发气体交换功能障碍以及肺功能不可逆性丧失[1-3]。矽肺发病机制复杂，PI3K/Akt信号通路激活已被证实在其中具有促进作用[4]。miR-489 与多种癌症细胞增殖相关，亦有研究表明其可能影响矽肺诱导的纤维化[5-6]。由此可见，miR-489可能通过调控肺纤维化相关信号通路如PI3K/Akt 信号通路而影响矽肺诱导的肺纤维化进程，但目前相关研究仍较少。因此，本研究通过建立矽肺小鼠动物模型，分析miR-489 促进矽肺诱导小鼠肺纤维化的作用及其与调控PI3K/Akt 信号通路的关系，旨在为明确矽肺发病机制以及矽肺的防治提供分子学依据，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 样本、仪器和试剂 SPF 级C57BL/6 雄性小鼠80 只，周龄4～5 周，均由重庆医科大学实验动物中心提供[许可证号：SCXK (渝) 2017-0015]。SPF 级C57BL/6 雄性小鼠80 只随机分为空白组、模型组、miR-489 组和对照组，每组小鼠20 只。各组小鼠均独立饲养，温度控制在22℃～24℃，湿度75%，明暗周期12 am/12 pm，采用标准饲料(北京中兴饲料公司)和纯净水(杭州娃哈哈集团)，小鼠均自由饮水和摄食，适应性饲养一周后进行相关实验研究。采用的仪器和试剂如下：SiO2粉尘(美国Sigma 公司)，miRNA 对照和miR-489 agomir(广州锐博生物)，HE 试剂盒和免疫组化试剂盒(英国Abcam 公司)，miR-489、PI3K、Akt 引物(上海生工)，RNA 提取试剂盒(德国Qiagen)，逆转录试剂盒(美国Promega)，SYBR Premix EXTaq和PCR试剂盒(日本TaKaRa)，Centrifuge 5920R离心机、微量移液器和RM2125 切片机(德国艾本德)，7900HT实时荧光定量PCR仪(美国ABI)，BM-V1 生物组织冷冻包埋机和TS-12F 生物组织自动脱水机(孝感市电子仪器厂)，过氧化氢和辣根过氧化物酶(北京博奥森生物)，二甲苯、4%多聚甲醛和酒精(上海化学试剂)，微波炉(中国美的)，低温冰箱(中国海尔)，ANTI-MOUL 光学显微镜(日本Nikon)，电泳仪(北京六一)，SPOT INSIGHT GOLO 照相系统(日本Olympus)。

1.2 实验方法

1.2.1 染尘操作 SiO2粉尘50 g精细研磨后进行高压灭菌，加入1 mL 的0.9%的氯化钠溶液中充分混匀制作SiO2粉尘悬液。模型组、miR-489 组和对照组均通过微量注射器经气管一次灌注50 mg/kg SiO2浓度的SiO2粉尘悬液，进行染尘操作从而建立矽肺小鼠模型，空白组不进行气管灌注染尘操作。染尘操作后四组均予以相同饲养条件和环境，饲养条件同1.1。

1.2.2 尾静脉注射 染尘操作30 d、45 d 后，miR-489 组给予3 nmol 的miR-489 agomir 尾静脉注射，模型组给予3 nmol的对照miRNA尾静脉注射，对照组同期尾静脉注射等量生理盐水，空白组不进行尾静脉注射操作。尾静脉注射操作后四组均予以相同饲养条件和环境，饲养条件同1.1。

1.2.3 免疫组化检测 染尘操作60 d后，均收集四组小鼠右下肺组织，进行免疫组化检测PI3K、Akt蛋白表达。将获取的肺组织常规进行福尔马林固定以及石蜡包埋并切制成厚度为0.4 μm的连续切片。二甲苯脱蜡后梯度酒精脱水去除二甲苯，内源性过氧化物酶灭活，抗原热修复，添加一抗40µL，20℃孵育60 min，添加二抗40µL，20℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染并进行返蓝、脱水、透明、吹干，进行中性树胶封片观察。显微镜下随机观察5个视野(200×)，PI3K蛋白、Akt蛋白均表达定位于细胞质和/或细胞核，细胞出现棕黄色、棕褐色、黄色颗粒为阳性染色，阳性染色细胞＜10%为阴性表达，阳性染色细胞≥10%时为阳性表达，统计四组小鼠肺组织的PI3K蛋白、Akt蛋白阳性表达率。

1.2.4 RT-PCR 检测 染尘操作60 d 后，均收集四组小鼠右上肺组织，常规进行研磨制成匀浆，常规行总RNA提取以及逆转录形成cDNA。采用RT-PCR法，以GAPDH 为内参基因和以2-ΔΔCt法检测比较四组PI3K、Akt的相对定量，以内标为snRNAde U6 RNA 和以2-ΔΔCt法进行miR-489 相对定量。各引物序列情况如下：U6 上游引物序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；下游引物序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。GAPDH上游引物序列：5'-CCCATGGCAAATTCCATGGCACC-3'；下游引物序列PI3K 上游引物序列：5'-ATTTCTTCCTAACTGCAGCG-3'；下游引物序列：5'-ATGGCAGCAGGCTTATACAGATAAGAC-3'。Akt上游引物序列：5'-TCAGTAGCATCCGGCAATATC-3'；下游引物序列：5'-TGCTGCAATCAAAGCCACAGTC-3'。miR-489上游引物序列：5'-GTATCCAGTGCGGTCCGAGGTATTCGCACTG-3'；下游引物序列：5'-TGCAGGGTCCGAGGTCAGACTGA-3'。PCR 反应体系组成如下：TaqMan MicroRNA Assay(20×)、正义链引物和反义链引物各1 μL，逆转录反应产物1.33 μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ10 μL，然后加DEPC水至20 μL。PCR反应条件如下：95℃预变性1 min、95℃变性0.5 min、60℃退火40 s、72℃延伸15 s，共进行40 个循环，72℃延伸10 min，将获得的PCR产物进行2%琼脂凝胶电泳，电脑分析CT值，根据相对定量分析方法，计算2-ΔΔCt为样本miR-489、PI3K、Akt的RNA相对含量值。

1.2.5 纤维化评分 染尘操作60 d 后，均收集四组小鼠左下肺组织，以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋并切制成厚度为0.4 μm的连续切片，常规行苏木精-伊红(HE)染色并在显微镜下(200×)进行四组肺组织病理学观察，并评价比较四组纤维化评分，纤维化评分[6]：分值0～5分，分值越高提示纤维化越严重，其中严重程度评判标准情况为0分为观察结果无异常，1分为边缘异常，2分为轻微异常，3分为重度异常，4分为严重异常，5分为异常非常严重；损伤情况评价为0分为没有发现损伤，1 分为发现少量或集会下出现的损伤且损伤占肺部面积≤10%，2 分为稀少和有限的损伤且损伤占肺部面积11%～25%，3 分为中度损伤且损伤占肺部面积26%～50%，4分为扩增性或广泛分布的损伤且损伤占肺部面积51%～75%，5分为非常广泛和明显的损伤且损伤占肺部面积＞75%。

1.3 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行数据的统计学分析；计数资料以百分率表示且采用χ2检验或Fisher 确切概率法进行比较；计量资料均符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示，多组计量资料比较采用方差分析并通过SNK-q检验进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠肺组织PI3K、Akt 蛋白表达量比较 四组小鼠肺组织PI3K、Akt蛋白表达比较，空白组最低，其次为miR-489组，再次为模型组和对照组，空白组肺组织PI3K、Akt蛋白表达低于其他三组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；而miR-489组、模型组和对照组肺组织PI3K、Akt 蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表1和图1。

图1 四组小鼠肺组织PI3K、Akt蛋白表达免疫组化染色结果(免疫组化SP，200×)

表1 四组小鼠肺组织PI3K、Akt蛋白表达量比较[例(%)]

2.2 四组小鼠肺组织miR-489、PI3K、Akt mRNA相对表达量比较 四组小鼠肺组织PI3K、Akt mRNA相对表达量比较，空白组最低，其次为miR-489组，再次为模型组和对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；而模型组和对照组肺组织PI3K、Akt mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。miR-489 组miR-489 的mRNA 相对表达量高于空白组、模型组和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；空白组、模型组和对照组miR-489 的mRNA 相对表达量比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 四组小鼠肺组织miR-489、PI3K、Akt mRNA相对表达量比较()

表2 四组小鼠肺组织miR-489、PI3K、Akt mRNA相对表达量比较()

注：与空白组比较，aP＜0.05；与miR-489组比较，bP＜0.05。

2.3 四组小鼠肺组织病理学变化 四组小鼠肺组织纤维化评分比较，空白组最低，其次为miR-489组，再次为模型组和对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；而模型组和对照组纤维化评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见表3。HE 染色结果显示，空白组的清晰可见肺组织肺泡结构，肺泡壁纤薄完整且无扩张或充血水肿，支气管完好无明显异常，肺泡内无明显渗出，肺泡间质无炎症细胞浸润或增生纤维组织；模型组和对照组均出现肺泡间隔增厚以及数量众多且大小不一的矽结节，其内可见尘细胞、炎细胞和成纤维细胞，miR-489 组出现少量且先相对较小的矽结节，其内含有少量的尘细胞、炎细胞和成纤维细胞，见图2。

表3 四组小鼠肺组织纤维化评分比价比较()

表3 四组小鼠肺组织纤维化评分比价比较()

注：与空白组比较，aP＜0.05；与miR-489组比较，bP＜0.05。

3 讨论

3.1 矽肺肺纤维化情况及其危害 肺纤维化疾病常见，其成纤维细胞出现大量异常增殖、转化、分泌和沉积大量细胞外基质，肺泡上皮炎性损伤，损伤区域和间质中成纤维细胞转化，成纤维细胞出现增殖、活化以及迁移，从而导致肺间质病理改变，为慢性进行性纤维化性间质性肺炎，其病变局限于肺部，多发生于中老年男性人群[7-8]。肺纤维化可由多种因素导致，其中矽肺可通过二氧化硅粉尘引发肺组织弥漫性纤维化[9-10]。肺纤维化病程呈现进行性发展，可明显影响肺的气体交换，严重影响呼吸功能，严重者可因发展为呼吸功能丧失和呼吸衰竭而死亡，多数患者在确诊后2～5 年期间死亡，预后情况极差[11-13]。因此，明确矽肺等因素导致的肺纤维化发病机制，对肺纤维化进行有效防治十分必要。

3.2 PI3K/Akt 信号通路与矽肺肺纤维化的关系 肺纤维化的发病机制复杂，涉及多个病理生理过程及相关基因以及信号通路[14]。PI3K/Akt信号通路已被证实与肺纤维化密切相关[15-16]。PI3K 为信号传导酶，可被酪氨酸激酶受体、G 蛋白偶联受体、G 蛋白细胞因子受体、RAS蛋白相关GDP酶受体等激活从而发挥促进细胞增殖、黏附、分化等，可分为四种特异性底物，其中Ⅰ型PI3K参与Akt的激活其亚基之一与肺纤维化密切相关；而Akt是PI3K下游中的丝氨酸/苏氨酸激酶，有3 种异构体，可参与细胞增殖和分化，可通过激活mTOR、缺氧诱导因子1α等参与肺纤维化；此外，PI3K/Akt信号通路参与肺纤维化可能与其上游中的结缔组织生长因子激活、VEGF、ROS 等相关，且可能协同MAPK 信号通路共同影响肺纤维化发生发展[17]。本研究通过气管一次灌注SiO2粉尘悬液建立矽肺小鼠模型，其中肺纤维化明显小鼠的PI3K、Akt 蛋白和mRNA 表达水平均出现不同程度的升高，且随着肺纤维化程度的加重而升高，进一步证实了PI3K/Akt信号通路参与肺纤维化发生发展。而于小林[18]的研究中发现下调PI3K/AKT 信号通路的转录和表达有助于改善肺纤维化模型大鼠肺组织的病理恶化情况且有助于肺组织顺应性和呼吸功能的改善，亦证实了PI3K/AKT 信号通路参与肺纤维化，与本研究结论一致，而其调节干预为肺纤维化治疗的有效途径之一。

3.3 miR-489 与矽肺肺纤维化的关系 非编码单链小分子RNA 参与细胞的发育、分化、增殖、凋亡、迁移等多种细胞生物学行为调控，miR-489 是非编码单链小分子RNA的一种，在肿瘤细胞增殖等过程中具有催化作用，可通过调控多种信号转导通路而影响细胞的生长、分化、迁移、黏附、凋亡等过程[19-21]。且有研究证实，miR-489 可通过调控PI3K/Akt 信号通路而影响癌症发生发展[22-23]。因此miR-489 可能通过调控PI3K/Akt 信号通路而影响其肺成纤维细胞的增殖、转化等而影响肺纤维化病情，但其具体作用和机制尚不明确，有待研究证实。因此，本研究检测了矽肺诱导肺纤维化模型小鼠的miR-489表达情况，结果显示其在小鼠正常肺组织中具有一定的表达，而通过miR-489 agomir 提高miR-489 表达的同时，小鼠的肺泡间隔增厚以及出现增加的矽结节，其矽结节内可见尘细胞、炎细胞和成纤维细胞等，小鼠的肺纤维化程度加重，肺纤维化评分升高，PI3K、Akt 蛋白和mRNA 表达水平降低，进一步证实了miR-489 激活PI3K/Akt 信号通路，降低PI3K、Akt 表达，从而促进肺纤维化的推论，这与靳苏香等[6]的研究中miR-489 促进矽尘诱导小鼠肺纤维化成熟的结论一致，均表明miR-489 影响肺纤维化进展。吴秋云[24]的研究亦进行了动物实验研究，其研究中认为miR-489调控炎症通路表达而影响矽尘诱导的肺纤维化，而吸附miR-489 可激活炎症和纤维化信号通路影响肺纤维化病情，与本研究一致认为miR-489参与肺纤维化发生发展，miR-489 干预可作为肺纤维化治疗的有效途径之一。

3.4 不足和展望 综上所述，通过上调miR-489助于矽肺诱导小鼠肺纤维化的防治，抑制PI3K/Akt信号通路从而抑制其对小鼠肺纤维化的促进作用是其作用机制，上调miR-489抑制PI3K/Akt信号通路的药物研究可作为肺纤维化有效干预的有效方法。但本研究的样本量较小，且局限于动物小鼠实验，关于miR-489在人体矽肺导致的肺纤维化发生发展中的作用及其机制仍需进一步研究探讨证实。