铁死亡在非酒精性脂肪性肝炎发生发展中作用的研究进展

梁通，宋丽娟，王昀

（中国药科大学药物科学研究院, 江苏 南京 211198）

2003年，研究人员意外发现小分子化合物erastin靶向细胞的电压依赖性银离子通道2/3（voltage ependent anion-selective channel，VDAC2/3） 以 非 凋亡死亡形式选择性杀伤肿瘤细胞，这是铁死亡首次进入科研人员的视线[1]。直到2018年细胞死亡命名委员会（Nomenclature Committee Cell Death，NCCD）正式将铁死亡定义为新型细胞死亡，即胞内微环境扰动，铁依赖性的细胞程序化死亡[2]。通过电镜观察细胞肿胀、线粒体凝缩外膜破裂和嵴减少等超微结构变化，是判断铁死亡发生的金标准[3]。细胞死亡后向微环境中释放大量的脂质过氧化物产物，如丙二醛（malonaldehyde，MDA）和4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE），显著增强肝氧化应激态[4]。

普遍认为脂肪变性、铁超载、氧化应激和线粒体功能失调等是促进非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）发生发展的重要原因。目前NAFLD向非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）的转化机制不明，针对NASH的特效治疗药物尚未上市。临床治疗NASH采用运动减肥，并辅用吡格列酮、维生素E等药物缓解NASH病理表征，但不能完全逆转患者NASH表型[5]，NASH治疗亟待发现新的靶点。2019年日本Minoru Tanaka研究小组在胆碱缺乏同时补充乙硫氨酸的NASH模型小鼠身上发现，铁死亡是脂肪肝中最先发生的细胞死亡形式，特异性抑制肝细胞铁死亡，肝组织炎症几乎被完全抑制[6]。NASH患者临床检测结果显示血清铁蛋白和肝铁过载现象普遍存在[7]，而铁超载被认为是铁死亡发生的生化特征；同时，活性氧（reactive oxygen species，ROS）相关的氧化应激也是NASH发生发展的重要参与者，胞内的脂质代谢失衡导致ROS大量积蓄，是判断铁死亡发生的重要表征[8]。NASH临床表现出铁死亡相关的生化特征，提示铁死亡可能是临床患者NAFLD-NASH转化的重要参与者。

1 铁死亡

铁在胞质内大量积蓄，并通过芬顿反应（Fenton）生成非酶介导的亲酯性ROS，是铁死亡发生的必需途径。使用铁螯合剂和亲脂性抗氧化剂，分别从缓解细胞内铁超载压力及抑制细胞内ROS积蓄2个方面来缓解铁死亡[9]。迄今为止，通过电镜观察线粒体结构超微结构变化依旧是判断铁死亡发生的唯一标准，尚未发现铁死亡特异性生物标志物[3]。

1.1 铁超载促进铁死亡发生

维持细胞正常生命活动的前提是必须保证胞内铁离子浓度稳态。当发生铁代谢紊乱时，常导致Fe2+在细胞内大量积蓄，诱发铁死亡。细胞通过转铁蛋白/转铁蛋白受体系统将胞外非血红素铁导入细胞，沉默转铁蛋白基因有效缓解细胞内铁超载，显著抑制细胞铁死亡[10]。前列腺上皮跨膜蛋白3（six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3，STEAP3）是金属还原酶家族STEAP一员，具有亚铁还原酶活性，可将Fe3+还原为Fe2+。敲除STEAP 3基因可显著减少胞内Fe2+积蓄，抑制肝细胞铁死亡，改善肝移植患者愈后[11]；游离Fe2+以含水氧化铁纳米颗粒的形式安全稳定的储存在铁蛋白( ferritin light，FT）内，是机体维持细胞内铁离子氧化还原动态平衡的重要策略[12]；高尔基体空泡蛋白分选蛋白（vacuolar protein-sorting protein，VPS）转运系统调控FT靶向转移到溶酶体，扰乱VPS系统，使得Fe2+在胞内大量积蓄，H2O2在Fe2+存在下生成羟基自由基具有强氧化能力，开启链式反应，在细胞内实现非酶促脂质过氧化反应生成ROS，细胞铁死亡敏感性升高[13-14]。

1.2 活性氧积蓄驱动铁死亡发生

铁死亡被认为是一种脂质氢过氧化物积累驱动的细胞死亡模式[15]。肾上腺皮质癌细胞系NCIH295R在正常培养时自发铁死亡，需要额外补充转铁蛋白和硒元素抑制自发铁死亡现象。但用加入了转铁蛋白等添加剂，且富含多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）的培养基培养时，NCI-H295R仍会自发铁死亡。通过外源性给予单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）替代PUFA与膜磷脂结合，膜内ROS的积蓄被抑制，细胞表现出抗铁死亡表型[16-17]。这些研究结果表明铁死亡发生过程中PUFA参与的膜磷脂酰化，是铁死亡发生的必要环节。

长链脂酰辅酶A合成酶4（long chain acyl-coa synthetase 4，ACSL4）是PUFA过氧化上游代谢酶，并在NASH患者中显著高表达[18]。ACSL4激活PUFA生成乙酰化多不饱和脂肪酸( acetylated polyunsaturated fatty acid，PUFA-CoA）。PUFA-CoA在溶血卵磷脂酰基转移酶3（recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）等代谢酶的作用下掺入细胞膜，与膜磷脂结合生成含有PUFA的磷脂分子，掺有PUFA的磷脂分子被细胞质内O2、ROS等氧化物以非酶氧化方式生成脂质氢过氧化物 ( lipid hydroperoxide，LOOH），Fe2+通过Fenton反应催化脂质活性氧（lipid reactive oxygen species，L-ROS）生成，是铁死亡发生的必需驱动力[19-20]。高表达ACSL4，加速PUFA代谢，导致脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO）积蓄诱发铁死亡[21-22]。

NASH理论上是NAFLD向肝细胞癌发展的初始阶段，随着肝组织中脂质过度积蓄，造成脂毒性继而引发炎症，约20%的NAFLD患者会进展为NASH，继而恶化为肝硬化甚至肝癌。随着经济发展，人们的物质生活水平不断丰富，该病的发病率呈上升趋势。而1980年Ludwig等[23]对NAFLD的定义为“没有大量酒精摄入时出现的脂肪性肝病”，极易在患者对自己病症判断时造成误导，因此，2020年国际专家组建议以代谢相关脂肪性肝病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）取代现有命名NAFLD[24]。MAFLD是一类慢性肝病的统称，包括单纯性脂肪肝、NASH、肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。MAFLD近年来患病率逐年上升，2020年全球有近10亿人患病，对社会医疗和经济造成了剧烈冲击，成为世界性公共卫生问题。令人担忧的是，越来越多的儿童和青少年被诊断出MAFLD，并可能伴有与MAFLD密切相关的肝脏和心血管并发症甚至恶性肿瘤。NASH是MAFLD中的转折点，病情进展到NASH期，普适的临床治疗手段失去效果，当病情进展到终末期时，高风险肝移植成为唯一治疗手段，并且术后可能再次复发。NASH是一个复杂的失调性疾病，其复杂的发病机制导致NASH亚型的多元性，目前临床上把病人简单分为NASH和非NASH已经不再适合NASH临床治疗，这不仅要求NASH的临床诊断手段需要具有极高的灵敏性，更要求广大的基础药学研究者们需要更多的研究来描述NASH疾病的全貌，精准定义疾病的亚型。使得临床医生得到患者的诊断结果后，可以根据不同NASH亚型致病因素的区别进行合理的判断，实现精准药物治疗。

2 非酒精性脂肪性肝炎的诊断和治疗

肝组织活检是临床检测NASH的金标准，以大泡性或以大泡性为主的混合型肝细胞脂肪变性为主要诊断特征[25]。肝活检耐受性差，容易出现肝组织出血等并发症。临床患者急需无不良反应且耐受性好的无创检测手段，如血清生化检查、影像学检查等方法。临床使用核磁共振质子检测密度脂肪分数对肝脏脂肪含量进行定量，使用磁共振弹性成像和瞬时弹性成像等技术对肝纤维化指数和血生化指标进行检测，以上综合评定NASH进展程度的方法在临床实践中表现出替代肝活检检测NASH的潜力[26]。

与飞速发展的诊断手段相比，有关NASH的发病机制的研究进展缓慢。虽然有新的假说提出，也仅仅是从“二次打击理论”认为的脂类在肝脏细胞的细胞质内的聚集（第1次打击）触发了一系列的细胞毒素事件（第2次打击），导致了肝脏的炎症反应，发展为“多次打击理论”认为的NASH的发生发展是多种因素共同“努力”的结果，包括胰岛素抵抗、脂肪组织分泌的激素、营养因子、肠道菌群释放的内毒素（脂多糖）、铁沉积和氧化应激损伤等，这些因素作用于肝实质细胞，从而驱动NASH的发展[27]。这并没有进一步阐述脂质稳态、炎症和肝脏病变之间的潜在联系及调控机制。NASH药物研究的靶点主要从代谢、抗炎和抗纤维化3个方面选取靶点。这些药物虽然针对NASH纤维化阶段的治疗效果优异，能缓解NASH发展，并一定程度上改善患者病症，降低并发症的发生率，但是仍不能实现NASH到健康的逆转[28]。本文统计了通过改变生活方式以及近期靶向上述靶点治疗NASH的药物的临床研究现状（见表1）。

表1 非酒精性脂肪性肝炎药物临床研究进展Table 1 Progress of clinical research on drugs against non-alcoholic steatohepatitis

3 铁死亡与非酒精性脂肪性肝炎

现在NASH的临床治疗药物多是靶向代谢、炎症或纤维化角度选取的治疗靶点，虽然可以缓解NASH纤维化等部分表征，但是无法彻底治愈NASH，并且用药时常伴有强烈的不良反应，因此，临床医生们迫切需要疗效强、不良反应弱的治疗药物治疗NASH。而药学工作中需要做的就是为他们提供靶向性更强更有效的新型治疗靶点。2019年Tsurusaki等[6]在小鼠的胆碱缺乏同时补充乙硫氨酸的饮食模型中发现，使用铁螯合剂deferiprone可以显著地缓解脂肪性肝炎发生时的临床症状和血生化指标，几乎完全阻止肝炎的发生，证实铁死亡是NASH发生发展的重要参与者。同时Tsuchida等[35]在蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的NASH小鼠模型中证实了铁死亡的发生，给予铁死亡抑制剂后，肝细胞内脂滴堆积减少，肝脂肪变性显著改善。在临床表征与NASH患者最接近的高糖高脂模型中，额外给予低铁饲料饲养的模型小鼠，细胞铁死亡敏感性降低，NASH的发展被限制[36]。铁死亡的细胞的多种脂质过氧化产物作为预炎性物质促进NASH发生发展，如大量的ROS引起的炎症可能是NASH发病机制之一，通过罗格列酮抑制ACSL4，减少肝组织内氧化应激态，缓解NASH发生发展[37-40]。这些证据显示铁死亡与NASH的发生发展可能息息相关。

3.1 铁过载诱发铁死亡诱导非酒精性脂肪性肝炎发生发展

十二指肠肠上皮细胞经过二价金属离子转运体-1（divalent metal-ion transporter-1，DMT1） 吸收饮食中的Fe3+，同时将Fe3+还原成Fe2+，通过膜铁转运蛋白（ferroportin，FPN）外排进血液，在血液中与铁蛋白结合形成血红素铁转运到身体各处[41]。肝门脉循环的首过效应，使得肝脏铁暴露量远大于其他组织，导致肝脏结构功能病理变化，造成肝损伤和多种并发症[42-43]。

临床检测发现慢性肝病常伴有血清铁蛋白升高，血清铁蛋白是临床检测机体铁稳态的生物标志物，当血清中铁蛋白含量异常时，肝脏作为负责清除血清铁蛋白的脏器超负荷运转进一步加重了肝脏损伤[38]。间质隔室检测出铁超载的MAFLD患者进展为NASH的风险高于其他亚型[44]。另一方面，肝脏是机体内重要的铁库，约占机体储存铁含量1/3，肝组织铁代谢失调导致大量游离铁的产生，肝组织细胞对铁死亡的敏感性显著提升[45]。胞内不稳定铁成分增加，通过Fenton化学反应和哈伯-韦斯（Haber-Weiss）反应促进了高反应性自由基（例如羟基自由基）的形成，诱导了长链PUFA的消耗，促进轻度微泡产生和大泡脂肪变性从而诱发肝脂肪变性和炎症，缺铁饮食和使用维生素E等抗氧化剂可显著缓解肝病的发生发展[46-49]；NASH患者组织切片显示炎症相关巨噬细胞聚集处是从门脉三叉向周围区域扩散，分布模式与肝铁沉积模式相似[50]。高胆固醇饮食（high cholesterol-containing diet，HFCD）NASH模型小鼠中铁调素mRNA转录水平显著升高，大量肝细胞FPN降解，细胞铁含量过载，肝细胞铁死亡敏感性显著升高[51-52]，铁超载刺激脂滴形成导致肝脂肪变性、巨噬细胞M1活化、促进肝纤维化、促进NASH发展[53-54]。

3.2 活性氧所致的铁死亡诱导非酒精性脂肪性肝炎发生发展

将PUFA的氧化物掺入磷脂中是铁死亡的核心步骤，储存有大量脂滴的肝细胞，受到外界刺激引起代谢异常，铁死亡敏感性升高[20,55]，研究证明铁死亡是脂肪变性的结果之一。细胞死亡后向外界环境中释放出大量的脂质过氧化产物，促进炎症发展。过氧化次级产物MDA和 4-HNE参与NASH发生发展的所有阶段，是NASH多种组织学特征的“始作俑者”[56]。

肝细胞脂滴内沉积大量PUFA激活肝细胞线粒体应激，破坏线粒体呼吸链功能，直接导致线粒体产生大量ROS[57]，同时触发相邻线粒体ROS产生与释放，不同空间位置的线粒体，通过特殊的ROS介导的信号传输网络相互串扰激活，使得细胞内的氧化还原失衡的信号在这些网络中传播放大，加速细胞内ROS积蓄，从而细胞对铁死亡敏感性升高[40,58]。细胞死亡后释放出大量的ROS，改变肝细胞生存环境，进一步促进细胞发生铁死亡、凋亡或自噬，从而促进炎症和肝纤维化的发生发展[59]。

3.3 其他

NASH患者ACSL4蛋白表达水平显著升高，ACSL4优先选择将花生四烯酸( arochidonic acid，AA）酰基化，促进AA与膜磷脂结合形成花生四烯酸酰化的膜磷脂分子，细胞对铁死亡敏感性升高[25]。敲除ACSL4基因后，细胞对铁死亡诱导剂的敏感性显著降低，缓解肝损伤[60]。

蒿甲醚通过促进肝星状细胞 （hepatic stellate cell，HSC）的铁和脂质过氧化物的积累触发铁死亡发挥抗纤维化作用，给予比酚类抗氧化剂铁抑素-1（ferrostatin-1，Fer-1）抑制铁死亡后，蒿甲醚就丧失抗纤维化作用[61]；索拉菲尼在治疗晚期肝癌时，上调胚胎期致死异常视觉果蝇样1/Hu 抗原R（embryonic lethal abnormal vision drosophila-like 1/Hu antigen R，ELAVL1/HuR）表达和下调ZFP36表达，从而增强HSC对铁死亡的敏感性，促进HSC铁死亡，并抑制HSC活化，减轻肝纤维化[62-63]。

肝细胞铁死亡后释放出大量铁离子，巨噬细胞回收大量铁离子后，胞内铁积累会促进巨噬细胞向促炎症方向极化、以及通过Toll样受体4（toll like receptor4，TLR4）/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）通路促进肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子的表达。此外，铁元素还被报道可以调控巨噬细胞内的三羧酸循环（TCA），进而调控细胞因子的产生[64]；扰乱肝驻留巨噬细胞对炎症区域调节能力，大量促炎因子释放到外周血内，并募集大量免疫细胞到受损区域，铁过载也会提升T细胞内ROS水平，造成DNA损伤、降低T细胞响应能力。在分子机制上，铁离子可以在转录后调控层面调控细胞因子的产生、可能通过Tet蛋白负调控DNA甲基化、通过细胞色素的氧化还原过程调控T细胞线粒体功能[65]，进一步促进炎症发生发展。

4 结语与展望

NAFLD是世界上许多地方引起慢性肝病的主要原因，2020年我国一般人群中患病率为29.81%[66]。迄今为止，中国市场上尚无药物被批准用于临床治疗NASH[33]，临床主流治疗手段是调节性饮食运动与药物辅助治疗相结合，但是由于安慰剂效应和患者个体性差异等原因，目前缺少确切的实验数据证明运动及饮食疗效的优秀和稳定[33]。

铁死亡作为一种脂质过氧化依赖性细胞死亡，细胞死亡后释放出大量的脂质过氧化物，从这些化学物质角度分析可以解释许多临床NASH患者病理性的组织学结构。并且NASH患者检测出的铁超载状态以及与脂质过氧化物表征，与肝炎发展密不可分。进一步对铁死亡机制进行深入研究，有望为发现新的NASH治疗靶点提供新的研究方向。