超高效液相色谱-串联质谱法测定丝绵中17种氨基酸含量

文/任 冰 卢 鸯 王一薇 王晓晴 沈金金

丝绵是以蚕丝为原料加工而成的绵絮、被用材料。用丝绵作为填充物的蚕丝被因具有保暖、轻柔、舒适等优良特性而备受消费者青睐，已成为中国丝绸行业主打终端产品[1]。由于蚕丝是一种较为珍贵的资源，蚕丝绵的市场价值较高，一些不法商家受利益驱使，通过人为添加物质对丝绵进行增重，严重扰乱了丝绵及蚕丝被市场的健康发展，侵害消费者利益[2-3]。因此，GB/T 24252—2019《蚕丝被》标准中规定“蚕丝填充物不得进行增重处理，蚕丝总氨基酸含量实测结果应不低于95%”。

氨基酸分析仪在食品、饲料等样品的氨基酸含量测定中较多被采用[4-6]，但因该仪器设备价格昂贵且专属性强，在纺织类检测实验室较少配备，因此，GB/T 24252—2019《蚕丝被》标准制定中考虑到检测方法的推广而采用柱前衍生-液相色谱法，即蚕丝经水解后通过柱前衍生，再经过液相色谱对氨基酸衍生物的测定来得到17种氨基酸含量。液相色谱-串联质谱因结合了液相色谱的分离功能和质谱的高选择性、高特异性和高灵敏度等特点，尤其适用于多种目标化合物的筛查和确证分析。近年来，液相色谱-串联质谱法在茶叶、乳品、化妆品等产品的氨基酸分析中也得到了较多应用[7-9]。本文通过优化色谱和质谱条件，建立了采用超高效液相色谱-串联质谱测定17种氨基酸含量的方法，不需要衍生化，仪器分析过程在10 min内完成。方法应用于5批实际丝绵样品检测和判定，得到与增重定性试验一致的结论。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪（UltiMate 3000/TSQ Quantum Ultra，赛默飞世尔科技有限公司）；恒温烘箱（FD115型，宾德公司）；真空干燥箱（DZF-6020型，上海精宏实验设备有限公司）；分析天平（感量0.0001g，梅特勒-托利多公司）；超纯水系统（默克密理博公司）。

氨基酸标准品（Dr. Erenstorfer公司）：精氨酸（纯度91.3%）、赖氨酸（纯度88.19%）、组氨酸（纯度99.9%）、苯丙氨酸（纯度99.0%）、酪氨酸（纯度99.6%）、亮氨酸（纯度99.9%）、异亮氨酸（纯度99.5%）、蛋氨酸（纯度99.0%）、缬氨酸（纯度99.3%）、胱氨酸（纯度99.3%）、丙氨酸（纯度99.9%）、甘氨酸（纯度99.77%）、脯氨酸（纯度99.59%）、谷氨酸（纯度98.0%）、丝氨酸（纯度99.9%）、苏氨酸（纯度99.9%）、天冬氨酸（纯度99.7%）。乙酸铵、甲酸（色谱纯，美国ROE公司）；乙腈（色谱纯，艾利拓公司）；氮气（纯度为99.99%）。

方法试验及应用丝绵样品采购自市场和丝绵生产企业，共5批，每批数量不少于200g，均为100%桑蚕丝丝绵。

1.2 丝绵酸解方法

准确称取20mg丝绵样品置于水解管中，加入10mL浓度为6mol/L的盐酸，放置于冰水（0℃）中冷冻1min～2min，然后抽真空（近0Pa），充入氮气，再抽真空充氮气，重复3次后在充氮气状态下封口。封口后的水解管放置于（110±2）℃恒温烘箱中，水解24h。取出水解管，冷却至室温，混匀、开管，转移至50mL容量瓶中，用水多次冲洗水解管，并转移至容量瓶中，定容至刻度。吸取1mL水解液，放置在真空干燥箱中，于60℃下蒸发至干。准确加入2mL、浓度为0.01mol/L的盐酸，充分溶解后经0.45mm微孔膜过滤后进行仪器分析。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：Hypesil Gold C18（100mm×2.1mm，1.9mm）； 流动相： 0.01mol/L乙酸铵水溶液（含0.2 %甲酸）：乙腈=95∶5（体积比）；恒定流速：0.2mL/min；柱温： 25℃；进样量：10.0μL；检测模式：选择反应监测（SRM）模式，使用ESI源，正离子方式；喷雾电压：4000V；传输毛细管温度：300℃；蒸发温度：350℃；扫描时间：0.8s；特征离子及碰撞能量见表1。

表1 氨基酸的主要质谱参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

氨基酸由于带有氨基（—NH2）和羧基（—COOH），所以具有两性电解质性质，采用电喷雾源（ESI）离子源时，正离子模式较负离子模式下响应值更高。将各氨基酸分别配成一定浓度的标准溶液，采用直接针泵方式进样，在正离子模式下以各目标化合物准确的［M+H］+峰为母离子，进行 MRM 模式的二级质谱优化分析，选出信号较强的二级碎片子离子及各自的碰撞能量等参数，所得氨基酸的质谱参数见表1。

2.2 色谱条件优化

在色谱条件优化中，重点考察了甲酸、乙酸胺对氨基酸离子化效率的影响。当流动相中未添加甲酸时，丙氨酸不能正常出峰，同时异亮氨酸和亮氨酸保留时间相近，不能分离，见图1(a)。当流动相中加入适量甲酸后，异亮氨酸和亮氨酸可完全分离，见图1(b)。加入甲酸各氨基酸的响应值变化不明显，且丙氨酸的响应值始终较低。

图1 (a) 流动相未添加甲酸时异亮氨酸与亮氨酸的分离色谱图 (b) 流动相中添加0.2 %甲酸时异亮氨酸与亮氨酸的分离色谱图

为了解决丙氨酸响应低的问题，我们尝试在流动相中加入乙酸胺，以期提升该氨基酸的离子化程度，结果发现，当加入0.01mol/L乙酸铵后，丙氨酸的响应明显提升、峰形良好。通过条件优化，最终以含0.2 %甲酸的0.01mol/L乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，体积比95∶5。在优化后的色谱条件下，17种氨基酸均能有效分离且峰形良好，仪器分析过程在10 min内完成。

2.3 方法评价

利用逐级稀释法配制氨基酸混合标准溶液，在优化的色质谱分析条件下，考察了所建立方法的线性范围、相关系数、定量检出限(LOQs)（以色谱峰面积10倍信噪比计算），结果见表2。结果表明，甘氨酸、丙氨酸等8种氨基酸在50μg/L～500μg/L浓度范围内线性良好，其余9种氨基酸的线性范围为5μg/L～200μg/L，定量检出限在0.07mg/g～2.34 mg/g范围内，能满足丝绵中氨基酸的含量测定要求。选取1个样品，通过对同一个样品重复测定7次，各氨基酸含量相对标准偏差＜5%，其中胱氨酸和蛋氨酸因含量低于检出限而未计算。

表2 氨基酸的线性范围、相关系数、定量检出限和重复性

2.4 方法应用

对来源于市场和生产企业的5批丝绵样品分别按照本方法进行了总氨基酸含量的测定，同时按GB/T 24252—2019附录D的方法进行增重定性试验，结果见表3。

表3 5个丝绵样品的氨基酸含量与增重定性试验结果

由表3可知，采用本文方法测得2#、4#丝绵样品的总氨基酸含量均大于95%，所对应的水解液均无沉淀析出，为正常的丝绵，而1#、3#、5#样品的氨基酸含量在38.9%～62.7%范围内，低于75%，所对应的水解液有不同程度的沉淀析出，同时证实这3批丝绵样品中添加了其他非蛋白质类物质。

3 结论

本文介绍了基于超高效液相色谱-串联质谱快速测定17种氨基酸的方法。分析了色谱、质谱条件的优化过程，对方法的线性范围、相关系数、定量检出限及重复性等进行了评价，方法应用于5批丝绵样品的试验判定。形成结论如下：

（1）在优化后的色谱、质谱条件下，17种氨基酸均能有效分离并响应良好，定量检出限在0.07mg/g～2.34mg/g范围内，能满足丝绵中氨基酸含量测定的要求。

（2）与柱前衍生-液相色谱法相比，本方法不需要进行衍生反应，样品水解完成后可直接上机测试，仪器分析过程在10 min内完成，检测过程更简单、快速。

（3）采用本方法应用于丝绵样品发现，经过增重处理的丝绵样品总氨基酸含量明显降低，在识别丝绵增重上更准确。