上海市造血干细胞捐献志愿者口腔拭子样本的分型成功率及其影响因素

朱臻逸 ，杜克明 ，廖宽镇 ，刘宝松 ，张 钢 ，吕 军

1复旦大学公共卫生学院，上海，200032；2复旦大学中国残疾问题研究中心，上海，200032；3上海荻硕贝肯医学检验所有限公司，上海，201318；4上海市红十字会，上海，200040

我国造血干细胞志愿捐献者的采样一直以静脉血采样为主。虽然静脉血采样技术较为成熟，但存在着采样时间和空间受限的缺点，目前已经在一定程度上影响了造血干细胞志愿捐献者的采集积极性和主动性[1-2]。而作为另一种受时间和空间限制较小的采样方式，通过人体口腔拭子采集口腔黏膜脱落细胞，已经被国内外经验证明是一种更为便捷和安全的DNA获取方式，在技术层面也已经较为成熟[3-5]。但是，由于口腔拭子技术对于样本采集规范和保存条件等要求较高[6]，在2015年进行的上海市口腔拭子采样前期试点工作中，获得样本的分型成功率较低，效果不理想。目前国内外研究主要聚焦于口腔拭子的基因含量、基因质量与应答率、分离方法和实验条件[3-6]，结合其在造血干细胞捐献志愿者采样入库等社会实践工作的实际效果研究较少。经过本研究团队、上海市红十字会和实验室团队的合作努力下，应用口腔拭子进行造血干细胞志愿者入库采样的全流程规范与相关技术在上海市日渐成熟。为进一步了解该技术采集所得样本的分型成功率，本研究分析了2015-2018年上海市口腔拭子采样的分型成功率现状及其影响因素，旨在对口腔拭子采集法的有效性和可行性提供一定的数据和经验支持。

1 资料来源与方法

1.1 数据来源

本研究的研究资料分别来源于上海市承担造血干细胞样本检测的实验室和中华骨髓库上海分库，于2018年3-5月，共采集2015-2018年4年间的造血干细胞志愿者信息8104条。其中，实验室方面提供志愿者口腔拭子样本的检测结果信息，中华骨髓库上海分库方面则提供志愿者的造血干细胞资料库信息。

1.2 研究方法

上海市口腔拭子样本的检测实验，从试点成立开始一直由同一家检测实验室完成。通过前期关键知情人访谈及现场调查了解到，样本分型成功即可进行造血干细胞志愿者登记入库，是样本采集入库这一步工作的唯一指标，因此选取其作为本研究关注的核心指标。

本研究取得的志愿者口腔拭子样本检测结果信息条目包括志愿者的采样编号、实验室样本接收时间、样本首次检测时间、每个位点扩增次数和样本是否成功分型。取得的志愿者造血干细胞资料库信息包括志愿者的采样编号、性别、年龄、职业、学历、献血经历。

1.3 统计学方法

应用 Excel 2016建立数据库，采用VLOOKUP函数对志愿者资料库中的信息和样本检测结果进行精确匹配。应用SPSS 22.0进行统计学分析，主要采用描述性分析、卡方检验和logistic回归分析等统计学分析方法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 调查对象基本情况

共收集志愿者样本信息8104条，男性4486人(55.36%)，女性3618人(44.64%)。≤25岁和26-35岁的人较多，占比分别为44.39%和33.58%，36-45岁和46岁及以上的人占比分别为19.32%和2.31%。学历方面，初中及以下876人，占10.81%；高中及大专2473人，占30.52%；本科4258人，占52.54%；研究生497人，占6.13%。民族以汉族为主，占97.64%，非汉族占2.36%。户籍方面，上海和非上海人数接近，占比分别为47.58%和52.42%。

2.2 口腔拭子样本的分型成功率情况分析

对不同年份间的口腔拭子样本分型成功率进行比较分析，发现其分型成功率逐年递增，从2015年的96.97%上升至2018年的99.78%，经趋势卡方检验，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同年份口腔拭子样本分型率之间的差异 n(%)

目前造血干细胞志愿者入库采样的方式以静脉血采样为主，已经广泛使用了多年并被认为较为有效，可作为分型成功率的参考标准。因此，为了验证口腔拭子样本的分型成功率是否已达到较为可靠的水平，将2018年口腔拭子样本与2018年的传统静脉血样本的分型成功率进行比较，二者差异不具有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同采样方式分型成功率的比较分析

2.3 影响口腔拭子样本分型结果的单因素分析

对无序变量采用交叉表χ2检验，有序变量采用非参数检验，连续性变量采用t检验。结果显示，户籍、献血经历差异和样本采集检测时间间隔有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 影响分型结果的单因素分析 n(%)

2.4 影响口腔拭子样本分型结果的多因素分析

选择单因素logistic回归有统计学意义的变量 (性别、年龄、文化程度)，并纳入时间因素进行调整，采用条件参数似然估计的向前法进行logistic回归分析，回归模型的调整R2为0.17，模型结果可用。结果显示，户籍、献血经历和样本采集检测时间间隔是影响口腔拭子样本分型结果的因素(P<0.05)；另外，相较于2015年，2018、2017和2016三个年份的口腔拭子样本分型成功率更高。见表4。

表4 影响分型结果的多因素logistic回归分析

3 讨论

3.1 口腔拭子样本的分型成功率已经较为理想

研究结果显示，口腔拭子样本的分型成功率逐年增高，利用2018年的实验室数据，将口腔拭子采样方式分型成功率与现有成熟的静脉血采样的分型成功率进行比较，仅差0.17%，经卡方检验认为两者之间不存在差异。说明2018年口腔拭子样本已经可以达到与静脉血样本同样的效果。相关经验已经证明，从实验室技术的角度，该检测方法已经较为成熟[7]，尤其在口腔拭子和外周血的比较中，口腔拭子采集样本提取DNA的浓度与扩增成功率已经与外周血方式采集的无差异，其测序结果也与人类线粒体DNA剑桥参考序列没有差异[8]。因此，口腔拭子采集的样本目前已有较为可靠的成功率，能够促进造血干细胞入库工作顺利进行。

3.2 户籍、献血经历和采集检测时间间隔是影响口腔拭子样本分型结果的主要因素

研究结果显示，上海户籍志愿者的样本分型成功率高于非上海户籍，可解释为由于本次实验是在上海进行，上海户籍的志愿者与工作人员的交流更顺畅，本地居民对于本地政府工作的信任度和配合度比外地居民要高，户籍人口的民生满意度相较非户籍人口也会更高[9]，从而使得上海户籍志愿者样本的前期准备和现场采集会更加严格地按照科学规范进行，因此拥有更高的分型成功率。而相较于有献血经历的志愿者，没有献血经历的志愿者样本分型成功率反而更高，可能是由于没有献血经历的志愿者普遍对采样方式的依从性高，同时没有个人经验作为支撑，对医生建议非常重视，操作更加谨慎规范。而有过献血经历的志愿者，更熟悉传统静脉血采样流程，也较认可静脉血采样这一方式与效率，因此可能对口腔拭子这一方式的依从性较低，导致一些志愿者在采样过程中的流程规范性下降，成功率较低。

研究结果还显示，在口腔拭子采集的样本中，样本采集与样本检测的间隔时间越长，分型的成功率就越低，这是因为样本在采集之后的保存和运输过程中，可能会因为温度、湿度、微生物[10]等因素的影响导致DNA丢失或降解，使得样本成为无效样本。因此，采集与检测之间的时间间隔越长，由于保存不当而使得样本失效的可能性就越高。

3.3 优化关键环节有利于推动口腔拭子技术的有效应用

本研究结果提示，口腔拭子技术的有效应用依赖于以下几个关键环节：①优选口腔拭子采样人群[11]。根据本文的研究结果，在志愿者造血干细胞入库时，上海户籍、没有献血经历的志愿者口腔拭子样本相较于非上海户籍、有献血经历的志愿者分型成功率更高，因此在志愿者充足有选择余地的情况下，应尽可能选择上海户籍、没有献血经历的志愿者进行口腔拭子采样。②缩减采检时间间隔[12]。根据本文的研究结果，口腔拭子样本从采集到检测的时间间隔越长，其分型成功率就会越低，因此应尽可能地减少口腔拭子样本采集和实验室检测中间间隔的时间，例如在条件允许的前提下，由实验室直接进行取样，当天完成样本的实验室检测工作。③进一步加强现场采集管理工作。根据本文的研究结果，从2015年到2018年口腔拭子样本的分型成功率呈逐年上升的趋势。由于4年间实验室流程与技术未作更新，现场采集管理不断优化，可认为该结果是因为口腔拭子对于操作的要求较高，前期准备、采集过程和样本保管均有相应的要求，稍有不慎样本就会被微生物感染[13]，因此随着现场采集管理工作逐渐成熟规范，样本的分型成功率也逐渐上升。

综上所述，口腔拭子采集得到的造血干细胞志愿者样本已有较为可靠的分型成功率，可作为造血干细胞志愿者招募入库的一种极为方便、安全的补充采样方式。由于其受采样对象、操作规范化、运输保存环境等条件影响较大，因此在口腔拭子技术应用过程中，优化关键流程十分必要。