长春西汀注射液在小鼠永久性脑缺血小胶质细胞表型转化中的作用研究

陈青芳，赵顺英，温少红，董雯，刘文倩，龚婷，陈文涛，刘向荣，王拥军，2，3，4

缺血性卒中占卒中的70%以上[1]，其高致残率严重威胁我国人民健康，并造成了重大的社会经济压力[2-3]。缺血性卒中后由于血管闭塞，远端脑组织缺血缺氧，线粒体呼吸受抑制，组织炎症反应增加，从而造成脑组织的损伤[4-6]。小胶质细胞是中枢神经系统固有的免疫细胞，也是卒中后炎症响应的关键细胞，其活化分为M1和M2两种极化状态[7]，通过促炎和抗炎的双重作用影响着损伤区域脑组织炎性反应的发展[8-9]。

长春西汀是从小长春花中提取的一种生物碱，广泛应用于脑血管、心血管和视网膜缺血性疾病的治疗[10-11]。基础和临床研究显示，长春西汀可抑制缺血组织的炎性细胞浸润，抑制内毒素诱导的肿瘤诱导因子、IL-1β的上调，并通过核因子κB/蛋白激酶B（nuclear factor kappa-B/protein kinase B，NF-κB/Akt）通路降低炎性因子的表达[12-15]。长春西汀能否改善永久性脑缺血后的炎性反应和神经功能损伤尚未见报道。本研究采用小鼠大脑中动脉远端闭塞模型模拟脑局灶性永久性脑缺血，之后连续给予长春西汀注射液治疗14 d，探究其在脑缺血后对神经功能的改善作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性C57BL/6J小鼠36只，体质量24±0.5 g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供。在24±2 ℃，湿度55%±5%环境中适应性饲养1周后随机分组，自由饮食饮水。本研究按照北京神经外科研究所动物房伦理实施（动物伦理批号：201904019）。

1.2 药品与剂量 按照体表面积将长春西汀注射液（河南润弘制药股份有限公司，规格2 mL：10 mg，生产批号1810202）的成人每日给药剂量（0.5 mg/kg，6 mL）等剂量换算为小鼠使用剂量（4.55 mg/kg，21.84 μL）参考药物说明书用生理盐水稀释至150 μL。

1.3 模型制作与给药 小鼠称重后异氟烷麻醉，分离颈总动脉，右侧俯卧位，暴露并磨透颅骨，暴露右侧大脑中动脉远端。本研究共分为4组：①永久性脑缺血组6只，高频电刀凝断右侧大脑中动脉远端，多普勒血流量仪监测凝断点远心端无血流代表电凝成功，后续不进行任何药物或生理盐水处理；②生理盐水组12只，凝断右侧大脑中动脉远端20 min后第1次尾静脉注射生理盐水5 min，之后每日1次至14 d，每次注射150 μL；③长春西汀组12只，凝断右侧大脑中动脉远端20 min后第1次尾静脉注射长春西汀5 min，之后每日1次至14 d，每次注射稀释后的长春西汀注射液150 μL（4.55 mg/kg）；④假手术组6只，仅暴露大脑中动脉远端，不电凝不给药。

1.4 神经功能与运动评价 模型成功后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d和14 d分别进行改良加西亚神经功能评分和转棒测试。改良加西亚神经功能评分包括躯体本体觉、胡须碰触、肢体对称性、侧转向和前肢行走5项，每项满分3分，总分15分[16]。转棒测试中，每只小鼠每天测试3次，每次间隔时间为15 min，避免小鼠疲劳。记录每次训练时小鼠在跑步机上的速度和时间，评价其神经功能。

1.5 组织免疫荧光染色 模型成功后14 d，生理盐水组和长春西汀组各取7只小鼠，假手术组和永久性缺血组各取6只小鼠，处死后全脑冰冻切片。从前至后每隔1 mm选取20 μm厚的1片切片用神经元核抗体（NeuN抗体，Millipore，美国）染色，Vectra Polaris病理成像系统（Perkin-Elmer，美国）拍摄确定神经元损伤体积，用ImageJ软件进行数据分析，每层神经元损伤体积=神经元损伤面积×层厚，总神经元损伤体积为每层神经元体积之和。

模型成功后14 d每组取3只小鼠，处死后全脑冰冻切片。用离子化钙结合适配分子1抗体（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1，Abcam，英国）和CD16/32（BD biosciences，美国）或Iba1和CD206（R&D systems，美国）共染评价小胶质细胞表型转化情况。Iba1和CD16/32阳性为M1型小胶质细胞，Iba1和CD206阳性为M2型小胶质细胞。用LSM710激光共聚焦显微镜（Carl Zeiss AG，德国）进行数据采集，每只小鼠随机选取3个梗死区周围视野进行相对荧光定量分析。实验流程图如图1。

图1 实验流程图

1.6 统计方法 采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行统计，计量资料数据呈正态分布，表示为，多时间点重复测量的指标组间比较采用双因素方差分析，单时间点的指标组间比较采用单因素方差分析，在整体差异有统计学意义的情况下进一步两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间神经功能评分 术后3 d、5 d、7 d、9 d、11 d和14 d评价小鼠改良加西亚评分，4组间躯体本体觉、胡须碰触、肢体对称性、侧转向和前肢行走5个分项评分及总分差异均有统计学意义（表1）。两两比较显示，除3 d时的躯体本体觉、胡须碰触和前肢行走评分外，永久性脑缺血组其余各时间点各分项评分及总评分均低于假手术组，差异有统计学意义；生理盐水组与假手术组相比，除3 d时的胡须碰触评分、7 d和11 d时的肢体对称性评分、11 d时的前肢行走评分差异无统计学意义外，其余时间点生理盐水组各分项评分及总评分均低于假手术组，差异均有统计学意义，另外，生理盐水组11 d时肢体对称性评分还显著高于永久性脑缺血组；长春西汀组3 d、7 d、9 d、11 d、14 d时躯体本体觉评分，3 d、7 d、11 d和14 d的肢体对称性评分，3 d、7 d时胡须碰触评分，各时间点侧转向评分，3 d、9 d时前肢行走评分及各时间点的总分均低于假手术组，差异有统计学意义；长春西汀组7 d时躯体本体觉评分、11 d时侧转向评分、14 d时肢体对称性评分、11 d和14 d时的总分均高于永久性脑缺血组，差异有统计学意义。

表1 术后各组小鼠不同时间改良加西亚评分表

2.2 转棒运动测试 模型成功后各组小鼠转棒运动测试在转棒上停留的时间和运动速度整体差异有统计学意义（表2）。其中长春西汀组14 d的转棒运动时间（P=0.024）和运动速度（P=0.019）比永久性脑缺血组显著增加。

表2 术后各组小鼠不同时间转棒测试表

2.3 神经元损伤 模型成功后14 d免疫荧光染色标记神经元，假手术组无神经元损伤，永久性脑缺血组、生理盐水组和长春西汀组的神经元损伤体积分别为16.39±3.26 mm3、13.87±3.00 mm3和5.06±0.38 mm3。4组整体差异有统计学意义（F=11.34，P＜0.001），两两比较显示，永久性脑缺血组（P＜0.001）和生理盐水组（P=0.001）神经元损伤体积大于假手术组，长春西汀组神经元损伤体积小于永久性脑缺血组（P=0.008）和生理盐水组（P=0.037）。代表性染色图可见永久性脑缺血组和生理盐水组小鼠右脑缺血灶周围神经元损伤明显，长春西汀组神经元损伤相对较小（图2）。

图2 术后14 d小鼠脑神经元染色代表图

2.4 小胶质细胞极化 术后14 d免疫荧光染色检测小胶质细胞极化情况，4组间M1型小胶质细胞（CD16/32阳性）表达整体差异有统计学意义，两两比较显示，永久性脑缺血组（P＜0.001）和生理盐水组（P=0.005）M1型小胶质细胞表达高于假手术组，长春西汀组M1型小胶质细胞表达水平低于永久性脑缺血组（P＜0.001）和生理盐水组（P=0.038），表明长春西汀组抑制CD16/32阳性的小胶质细胞的增加。4组间M2型小胶质细胞（CD206阳性）表达整体差异有统计学意义，两两比较显示，长春西汀组M2型小胶质细胞表达水平显著高于假手术组、永久性脑缺血组和生理盐水组（均P＜0.001）（表3）。图3为4组小鼠小胶质细胞表型表达的免疫荧光染色代表图。

图3 术后14 d小鼠缺血侧皮层梗死周围小胶质细胞免疫荧光染色代表图

表3 模型成功后14 d小鼠小胶质细胞极化荧光强度数据

3 讨论

既往研究证明，长春西汀能够抑制大鼠脑组织的炎性反应，减少大鼠脑缺血再灌注后的脑梗死面积[17]，但其在永久性脑缺血损伤中是否有神经保护作用尚未见报道。本研究使用小鼠永久性脑缺血模型，连续给予长春西汀治疗，观察到长春西汀组能够增加造模14 d时小鼠脑梗死区周边的M2型小胶质细胞表达，减少M1型小胶质细胞的分布。另外，长春西汀还能减少小鼠脑缺血后的神经元损伤，促进神经元存活，提高小鼠的改良加西亚神经功能评分和增加转棒测试中的运动时长和运动速度，上述结果提示长春西汀可能具有促神经元修复并改善神经功能的作用。

缺血性卒中由于组织缺血缺氧，脑组织内炎性反应增加，并引发后续炎性级联反应。慢性的炎症反应可进一步加大脑组织损伤的范围和疾病的严重程度，是影响卒中转归的重要因素[5-6]。在生理状态下，脑组织内小胶质细胞处于静息状态，脑组织缺血后，小胶质细胞可极化为具有促炎、细胞毒性的M1型和具有抗炎、神经营养作用的M2型两种表型[18-19]。小胶质细胞的两种极化表型可以影响脑缺血局灶区域炎症反应的进程，并参与脑缺血后的神经营养与修复，从而影响疾病的预后。本研究中，小鼠永久性脑缺血后，长春西汀组减少皮层梗死周边CD16/32阳性细胞表达，增加CD206阳性细胞表达，提示给予长春西汀注射液治疗可促进小鼠永久性大脑中动脉远端缺血后小胶质细胞由M1向M2表型极化，抑制缺血区免疫炎症反应并促进组织修复，使得的炎性反应得到控制。长春西汀治疗可调控脑缺血后局灶炎症反应，从而改善永久性脑缺血后的炎性损伤，可能对小鼠长期损伤修复、疾病预后有积极意义。

本研究证实长春西汀注射液通过促进小胶质细胞极化为抗炎的M2型，并抑制促炎的M1型表达，调节小鼠脑内局灶炎症反应，减少小鼠永久性脑缺血损伤后的脑组织损伤，改善运动功能，可为缺血性卒中的临床治疗提供用药参考。但本研究中长春西汀组小鼠的改良加西亚评分各分项和总分、转棒测试结果与生理盐水组并无显著差异，可能是因为研究样本数量较少。另外，长春西汀如何影响小胶质细胞的极化尚需进一步研究。

【点睛】在小鼠大脑中动脉闭塞脑缺血模型中，长春西汀注射液可促使小胶质细胞极化为抗炎的M2型，减轻神经元损伤，经治疗后小鼠的神经功能改善也比较明显。本研究结果为长春西汀注射液治疗缺血性卒中提供了一定的理论依据。