肿瘤坏死因子-α通过Wnt通路对脑卒中小鼠缺血再灌注后脑微血管内皮细胞的影响研究

曹杰，曾辉，黄旭华

1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州 341000；2.南康区第一人民医院，江西 赣州 341400

脑卒中是由于脑内血管破裂或者阻塞引起的局部大脑血液供应不足，脑组织发生病变坏死的一种脑部疾病，其中大部分为缺血性脑卒中［1］。脑卒中发病人数多，有较高的死亡率和复发率。脑卒中对人机体损伤极大，每年患者不断增多。但治疗方式还十分缺乏，主要还是以预防为主［2］。近年来，抑制缺血再灌注导致的血脑屏障损伤已成为治疗脑卒中的新思路［3］，但近几年来未见相关文献报道。探讨肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对脑卒中小鼠缺血再灌注后脑微血管内皮细胞的影响的机制，对脑卒中的治疗有一定帮助。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF 级C57BL 小鼠80 只，6 周龄，体质量范围20～25 g，雌雄各半，购自武汉万千佳兴公司。饲养环境为（1）符合国标的生活环境；（2）符合国标的饲料；（3）无致病菌或无菌的饮用水。ELISA试剂检测盒（上海酶联生物科技有限公司）；Evans blue 染色剂（上海跃腾生物技术有限公司）；RTPCR 试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；显微镜。

1.2 实验方法

小鼠随机分为A 组（缺血0 min）、B 组（缺血时间30 min）、C 组（缺血时间45 min）、D 组（缺血时间60 min）。除A 组外小鼠利用线栓法［4］构建缺血再灌注小鼠模型。首先，刮掉小鼠颈部的毛，切开皮肤，分离周围组织使左侧颈总动脉显露，结扎左侧颈总动脉和颈外动脉近心端，插线栓入颈内动脉主干，缓缓推进，血流读数骤降停止推进，固定栓线。缺血时间到达之后，立即取出线栓，苏醒后根据Longas 评分标准［5］进行评分，1～3 分的小鼠纳入实验。1 d 后检测各项指标。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 ELISA 检测血清TNF-α 表达 每组各选取10只小鼠，取静脉血1 mL，按照ELISA 试剂盒说明书测定其中TNF-α 的水平。

1.3.2 Evans blue 法 每组另选取10 只小鼠，从眼窝静脉窦注射浓度为2%的Evans blue 至正常小鼠和脑卒中模型小鼠体内，每只小鼠注射200 μL。体内循环1 d，处死小鼠，取大脑并拍照。拍照之后，立即将大脑匀浆。通过酶标仪检测吸光度（OD620和OD740），计算出正常小鼠和脑卒中小鼠的脑内Evans blue 的浓度。

1.3.3 免疫组化检测 Wnt3a 表达用Wnt3a 单克隆抗体进行免疫组织化学染色。步骤：脱蜡、抗原修复，3%H2O2孵育10 min，滴加封闭用正常血清，PBS洗3 遍，室温孵育1 h，滴加1∶50 稀释的一抗，4℃过夜。PBS 冲洗，滴加辣根酶标记二抗，室温1 h，PBS 冲洗，DAB 显色剂显色。显微镜下拍摄，阳性表达呈棕黄色。

1.3.4 qPCR 技术检测Axin2、APCDD1 表达 提取总RNA 后，RT-PCR 试剂盒进行反转录，获得cDNA。通过荧光定量PCR 扩增目的基因。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s、62 ℃退火/延伸60 s，40 个循环。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠血清TNF-α 水平以及脑内Evans blue 浓度

A 组TNF-α 水平较低，B、C、D 组水平逐渐上升（F=2 064.955，P＜0.001）。A 组左脑Evans blue 浓度较低，B、C、D 组浓度逐渐上升（F=242.961，P＜0.001）。B 组与A 组、C 组与A 组、D 组与A 组在TNF-α 水平和左脑Evans blue 浓度均差异有统计学意义（P＜0.05）。各组右脑Evans blue 浓度差异无统计学意义（F=0.335，P=0.800）。见表2。

表1 小鼠血清TNF-α水平以及脑内Evans blue浓度（）

表1 小鼠血清TNF-α水平以及脑内Evans blue浓度（）

表2 小鼠脑微血管内皮细胞Axin2、APCDD1 mRNA相对表达（）

表2 小鼠脑微血管内皮细胞Axin2、APCDD1 mRNA相对表达（）

2.2 小鼠脑微血管内皮细胞Wnt3a 的表达

Wnt3a 主要以胞核表达为主。A 组小鼠Wnt3a表达很少，B、C、D 组表达依次增多。详见图1。

图1 小鼠脑微血管内皮细胞Wnt3a的表达（化学染色，×400）

2.3 小鼠脑微血管内皮细胞Axin2、APCDD1 mRNA的表达

A、B、C、D 组Axin2、APCDD1 mRNA 相 对表达依次增多（F=292.512，1 237.411，P＜0.001）。B 组 与A 组、C 组 与A 组、D 组 与A 组 在Axin2、APCDD1 mRNA 的表达差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

3 讨论

脑卒中多发于中老年人群体，且缺血性脑卒中发病率最高［7］。部分患者通过治疗虽然能够好转，但往往会产生一定程度的后遗症，并且预后状况也不佳。缺血性脑卒中使血脑屏障功能降低，并增加脑出血和脑水肿的风险［8］。研究表明，闭塞的脑血管在疏通之后再灌注，短时间内就能激活一系列的生化反应，引起神经兴奋毒性、炎性因子分泌增多等［9］。炎症因子（TNF-α）进一步激活脑血管内皮细胞，使淋巴细胞进入血脑屏障，分泌促炎因子，从而引起大脑内神经细胞大量死亡。本研究结果显示，随着缺血时间的增加，小鼠机体产生的TNF-α 增多，提示脑卒中会导致机体产生促炎因子TNF-α，且TNF-α 水平呈缺血时间依赖性，另外左脑的Evans blue 浓度上升，表明随缺血时间的上升血脑屏障功能下降。

Wnt 通路与脑血管生成、血-脑脊液屏障的形成及其生物学特征维持有重要联系。Wnt3a 为Wnt信号通路的起始蛋白［10］,其表达可激活Wnt 信号通路。本实验结果，小鼠脑微血管内皮细胞Wnt3a的表达逐渐上升。提示脑卒中小鼠的Wnt 通路被异常激活，随着缺血时间的增加，Wnt 通路被激活的情况更加严重。

Wnt 通路的靶基有Axin2、APCDD1。Axin 是一种构架蛋白,它能激发ß-catenin 磷酸化，又能被泛素蛋白酶体分解，导致Wnt 通路保持低活性［11］。APCDD1 因子是与Wnt 信号通路密切相关的膜结合糖蛋白［12］。APCDD1 作为内源性因子可激活或抑制经典Wnt 信号通路。本实验结果，脑卒中小鼠Axin2、APCDD1 的表达逐渐增加。提示Wnt 通路被抑制，随着缺血时间的增加，Wnt 通路的活性越低。

综上所述，研究发现脑卒中小鼠伴随着TNF-α 水平异常增加，Wnt 通路异常激活，脑微血管内皮细胞功能下降，Wnt 通路的靶基因表达上升。TNF-α 可能参与到调控Wnt 通路的活性来影响脑微血管内皮细胞功能。其具体机制还有待进一步研究。