HPLC-ELSD 法测定肾康宁颗粒中黄芪甲苷含量

龙白坚，夏国汉，黄东，吴良发

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

肾康宁颗粒由黄芪、丹参等八味中药组成，方中君药为黄芪，黄芪甲苷为主要活性成分之一［1-3］，处方中含黄芪的制剂大多以黄芪甲苷作为含量检测成分，目前未有关于测定肾康宁颗粒中黄芪甲苷含量的文献报道。由于黄芪甲苷只在201 nm 波长处有弱的紫外末端吸收，其它波长无明显的紫外吸收，选用高效液相色谱-紫外检测器方法或者薄层扫描法测定，检测结果不稳定［4-6］。参考相关文献［7-14］，本文建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法测定肾康宁颗粒中黄芪甲苷的含量，经方法学验证，该方法重现性好，准确率高，可作为肾康宁颗粒质量控制的技术手段之一。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪HPLC（型号：Agilent 1100），蒸发光散射检测器ELSD（型号：Alltech-2000）。黄芪甲苷对照品（含量测定用）购自中国食品药品检定研究院，批号：110781-201314。乙腈为色谱纯级，试验用水为超纯水，其它试剂均为分析纯。肾康宁颗粒：江西山高制药有限公司（批号：20100101、20100201、20110501、20110502、20100504，规格：每袋5 g）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备

取样品内容物，研细，取约12 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率：500 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过。精密吸取续滤液25 mL，蒸干，加水50 mL 分次溶解残渣，用水饱和的正丁醇溶液振摇提取4 次，每次30 mL，合并正丁醇溶液，用氨试液反复洗涤2 次，每次50 mL，取正丁醇溶液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 阴性样品溶液制备

除不加黄芪药材外，取其他七味药材按制法制成阴性样品，按照“2.2”项下方法制备阴性样品溶液,即得。

2.4 色谱条件

以Diamonsil C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）为色谱柱，柱温设为30 ℃；以水-乙腈（65∶35）为流动相，流速为1.0 mL/min；ELSD 参数设置：漂移管温度设为105 ℃，载气流速设为2.5 L/min；进样量为10 μL。按上述色谱条件进样分析，待测成分分离效果好，测定色谱图见图1。

图1 对照品（A）、供试品（B）、阴性样品（C）色谱图

2.5 线性范围

取对照品溶液适量，用甲醇配制成浓度依次为0.040 4、0.202、0.404、0.808、1.212 mg/mL 的系列对照品溶液，分别精密吸取10 μL 进样测定，以对照品进样量（X）的常用对数值为横坐标，以峰面积（Y）的常用对数值为纵坐标，进行线性回归分析，得到线性方程lgY=1.315 9lgX+5.833 6，r=0.999 9。结果表明黄芪甲苷在0.404～12.12 μg 之间与峰面积呈良好的对数线性关系。

2.6 精密度试验

取“2.1”项下对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6 次，每次10 μL，测定峰面积，结果峰面积RSD 为1.8%，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

样品配制0，6，12，18，24 h 后精密吸取同一供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，结果测定峰面积RSD 为1.6%，表明供试品溶液在24 h 之内基本稳定。

2.8 重复性试验

制备供试品溶液6份，分别进样10 μL测定含量，结果平均含量为0.135 6 mg/g，RSD 为1.9%。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（含量为0.135 6 mg/g），研细，取6 份，每份约6 g，精密称定，加入浓度为0.016 16 mg/mL 的黄芪甲苷对照品甲醇溶液50 mL，按“2.2”项下方法制备加标溶液，按上述色谱条件，分别精密吸取10 μL，进样测定，计算回收率，结果见表1。

表1 黄芪甲苷加样回收试验结果（n=6）

2.10 样品测定

取5 批样品，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定黄芪甲苷峰面积，采用回归方程计算含量，结果见表2。

表2 样品中黄芪甲苷含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 提取方法的考察

通过对不同提取方式（超声、回流、振摇）、溶剂种类（甲醇、50%甲醇、水）和正丁醇振摇提取次数（1、2、3、4、5 次）等影响因素的考察，发现样品用甲醇超声处理30 min 后，再加正丁醇振摇提取4 次，氨试液洗涤2 次，色谱峰杂质干扰较少，黄芪甲苷含量最高，故采用“2.2”项下方法制备供试品溶液。

3.2 蒸发光散射检测器条件的考察

影响蒸发光散射检测器信号响应的主要因素是载气流量和漂移管温度，经对载气流量和漂移管温度对基线和峰面积影响的考察，确定载气流量为2.5 L/min、试验温度为105 ℃时分离效果好，基线稳定。

3.3 样品测定结果分析

表2 表明不同批号的样品黄芪甲苷含量有差异，肾康宁颗粒为独家品种，样品来源相同的前提下，批间差异可能是黄芪原药材或者生产工艺不稳定造成的。因此，固定黄芪原药材产地，保障药材质量和工艺稳定性可以有效减少批间差异，提高药品质量稳定性和均一性。经调研，黄芪甲苷在成品中的平均转移率约为30%，《中国药典》2020 年版一部规定黄芪中黄芪甲苷的含量不得低于0.080%，若按0.080%计算，则本品每袋含黄芪甲苷应不少于0.43 mg，《中国药典》2020 年版一部收载的肾康宁颗粒规定的黄芪甲苷含量限度偏低。