小儿咳喘灵颗粒质量标准提升

刘薇，肖文涛，杨群，邓维

1.九江市食品药品检验所，江西 九江 332000；2.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西 南昌 330029

小儿咳喘灵颗粒是由麻黄、金银花、板蓝根、苦杏仁、甘草、石膏和瓜蒌七味药组成的成方制剂，收录于《卫生部药品标准中药成方制剂》第四册（WS3-B-0688-91），具有宣肺、清热，止咳、祛痰、平喘功效［1］。临床常用于上呼吸道感染，气管炎，肺炎，咳嗽等［2］。现行质量标准项下仅有两项化学鉴别，未涉及薄层色谱鉴别及含量测定指标和方法,无法对处方中的有效成分进行质量控制。本研究拟用薄层色谱法对制剂中的苦杏仁中的苦杏仁苷进行定性鉴别，对处方中5 种成分盐酸麻黄碱、（R，S）-告依春、绿原酸、木犀草苷、甘草苷的含量用同一液相色谱系统同时测定，为进一步提高小儿咳喘灵颗粒质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695-2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；YIY-UL300W-C 型超声波清洗器（上海艺源超声设备有限公司）；BSA124S 型电子天平（德国sartorius 公司）；BP211D 型电子天平（德国sartorius 公司）；硅胶G 薄层板（10 cm×20 cm，德国默克公司）。

1.2 材料

盐酸麻黄碱（批号为171241-201007，含量以99.7%计）；（R，S）-告依春（批号为111753-201106，含量以100% 计）；绿原酸（批号为110753-201716，含量以98.0%计）；木犀草苷（批号为111720-200504，含量以100%计）；甘草苷（批号为111610-201005，含量以94.9%计）；苦杏仁苷（批号为110820-201808，含量以88.2%计）对照品购自中国食品药品检定研究院。甲醇和磷酸为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。3 批小儿咳喘灵颗粒样品（批号：190405、190512、191203，规格为每袋2 g）均购自四川恩威制药有限公司，依次编号为A1～A3。

2 方法与结果

2.1 苦杏仁苷TLC 鉴别

供试品溶液：取小儿咳喘灵颗粒6 g，加乙醚低温超声30 min，弃去乙醚液，药渣挥干；加甲醇30 mL 超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 mL 使溶解，通过D101 型大孔吸附树脂柱（内径1.5 cm，长8 cm，加水20 mL 预洗一次），弃去水液，用氨试液30 mL 洗脱，弃去氨液，再用水10 mL洗脱，弃去水液，用20%乙醇溶液30 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得［3］。对照品溶液：取苦杏仁苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液。按处方比例和制法制备缺苦杏仁的阴性对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2015 年版四部通则0502）试验，吸取供试品溶液3 μL，对照品溶液与阴性对照品溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）5～10 ℃放置12 h 的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点且阴性对照无干扰。结果见图1（日光）。

图1 薄层色谱图

2.2 5 种成分的含量测定［4-15］

2.2.1 色谱条件 采用Venusil MP C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸；梯度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：0～15 min，207 nm；15～25 min，327 nm；25～35 min，237 nm；35～40 min，350 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取盐酸麻黄碱对照品15.79 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，取出，放冷加适量甲醇定容，制成629.70 μg/mL 的对照品储备液。精密称取绿原酸对照品9.32 mg，置25 mL 容量瓶中，超声处理15 min，加适量甲醇定容，制成365.30 μg/mL 的对照品储备液。精密称取告依春对照品9.66 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，放冷，甲醇定容，制成386.40 μg/mL 的对照品储备液。精密称取甘草苷对照品8.01 mg，置25 mL 容量瓶中，超声处理15 min，加适量甲醇定容，制成304.00 μg/mL 的对照品储备液。精密称取木樨草苷对照品9.17 mg，置25 mL 容量瓶中，超声处理15 min，加适量甲醇定容，制成366.80 μg/mL 的对照品储备液。

2.2.3 样品溶液的制备 取样品，研细，从中称取约2 g，精密称定，加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理（功率300 W，频率25 kHz）20 min，放冷后，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得样品溶液。

2.2.4 专属性实验 分别吸取供试品溶液、对照品溶液以及阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，比较供试品溶液、对照品溶液及阴性对照溶液色谱图。结果表明供试品中五种色谱峰与杂质峰有较好的色谱分离，阴性对照无干扰。见图2。

图2 高效液相色谱图：A.对照品溶液；B.小儿咳喘灵颗粒样品溶液；C.阴性对照溶液

2.2.5 线性关系的考察 取绿原酸对照品储备液，分别加适量甲醇制成1 mL 中含3.65、7.31、14.61、21.92、29.22、36.50 μg 绿原酸的标准系列溶液，使用高效液相色谱仪进行测定，以其质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=21 084.595 2X+28.329 1，r=0.999，绿原酸在3.65～36.50 μg/ mL 之间呈良好的线性。

取盐酸麻黄碱对照品储备液，分别加适量甲醇制成1 mL 中含6.29、12.59、25.18、37.78、50.37、62.97 μg 盐酸麻黄碱的标准系列溶液，使用高效液相色谱仪进行测定，以其质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=25 351.509X-5 999.754 3，r=0.999，盐酸麻黄碱在6.29～62.97 μg/ mL 之间呈良好的线性。

取告依春对照品储备液，分别加适量甲醇制成1 mL 中含3.86、7.72、15.45、23.18、30.91、38.64 μg告依春的标准系列溶液，使用高效液相色谱仪进行测定，以其质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=180 916.440 2X-10 717.480 5，r=0.999,告依春在3.86～38.64 μg/mL之间呈良好的线性。

取木樨草苷对照品储备液，分别加适量甲醇制成1 mL 中含3.67、7.34、14.67、22.01、29.34、36.68 μg木樨草苷的标准系列溶液，使用高效液相色谱仪进行测定，以其质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=41 563.933 2X-3 956.141 3，r=0.999，木犀草苷在3.67～36.68 μg/mL 之间呈良好的线性。

取甘草苷对照品储备液，分别加适量甲醇制成1 mL 中含3.04、6.08、12.16、18.24、24.32、30.40 μg 甘草苷的标准系列溶液，使用高效液相色谱仪进行测定，以其质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=22 763.873 5X-391.572 6，r=0.999,甘草苷在3.04～30.40 μg/ mL 之间呈良好的线性。

2.2.6 精密度试验 取浓度为36.50 μg/mL 的绿原酸对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6 次峰面积，RSD 值为0.40%。取浓度为62.97 μg/mL 的盐酸麻黄碱对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6次峰面积，RSD 值为0.33%。取浓度为38.64 μg/mL的告依春对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6次峰面积，RSD 值为0.29%。取浓度为36.68 μg/mL的木樨草苷对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6 次，RSD 值为0.33%。取浓度为30.40 μg/mL 的甘草苷对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6 次峰面积，RSD 值为0.26%。证明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密称取小儿咳喘灵颗粒2 g，按“2.2.3”的方法制备样品溶液，精密吸取供试品溶液（批号：191203）10 μL，分别放置0、2、4、8、12、24 h后进样测定，结果表明样品溶液中绿原酸、盐酸麻黄碱、告依春、木樨草苷、甘草苷在24 h 内峰面积无明显变化，RSD 分别为1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、1.3%。

2.2.8 回收率试验 精密称取样品1.0 g，共六份，置25 mL 量瓶中，分别加入+含盐酸麻黄碱对照品（0.103 mg/mL）、绿原酸对照品（4.040 mg/mL）、告依春对照品（0.204 mg/mL）、甘草苷对照品（0.458 mg/mL）和木樨草苷对照品（0.101 mg/mL）各0.8、1.0、1.2 mL，加入甲醇15 mL，超声处理（功率300 W，频率25 kHz）20 min，定容，摇匀，滤过，按上述色谱条件测定，计算回收率。结果见表2～6。

表2 盐酸麻黄碱回收率

表3 绿原酸回收率

表4 告依春回收率

表5 甘草苷回收率

表6 木樨草苷回收率

2.2.9 样品含量测定 精密称取小儿咳喘灵颗粒样品适量，按“2.2.3”的方法制备样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样测定2 次，计算样品中5 种成分的含量，结果见表7。

表7 样品中5种成分的含量测定结果（mg/袋）

3 讨论

3.1 苦杏仁苷的薄层色谱鉴别

现行检验标准未对处方中苦杏仁药材进行质量控制，查阅相关文献少见小儿咳喘灵颗粒研究方法中对苦杏仁的鉴别方法。在试验中参考苦杏仁药材的薄层方法［16］，同时对比用索氏提取、二次回流、超声提取等不同提取方法，结果分离效果不理想，苦杏仁阴性样品斑点干扰成分较多。考虑处方中药材成分互相干扰，组方中有多数含糖成分，会造成不易分离且拖尾等，为了改善分离效果，故用大孔树脂柱层析法，结果证明用大孔树脂柱层析法能有效洗脱杂质干扰成分，且分离效果较好，阴性对照无干扰。

3.2 含量提取方法优化

对提取溶剂（甲醇、75%乙醇、50%甲醇、水），提取方法（超声法、回流法、浸提法），提取时间（10、30、40、60 min）进行了比较，最后确定用50%甲醇超声处理30 min 为最佳。

3.3 流动相选择

比较乙腈-0.1%磷酸、甲醇和水两种系统，其中乙腈-0.1%磷酸峰形及分离度较好，保留时间也较为理想。也考察了磷酸的浓度0.1%、0.2%、0.3%。其中0.1%的磷酸浓度分离效果较好，故选择表1中的梯度洗脱法。

3.4 检测波长选择

木犀草苷的最大波长是350 nm，而盐酸麻黄碱、（R，S）-告依春、绿原酸、甘草苷分别为207、245、237 nm，不能以同一波长对这5 种成分进行紫外检测。经实验用紫外检测液相色谱法直接切换不同波长进行含量测定方法较为方便，同时在同一个系统中测定5 个组分，故选用波长切换法进行检测。

本研究对小儿咳喘灵颗粒质量标准进行了相应提升，建立的薄层鉴别和含量测定方法专属性强，能有效对小儿咳喘灵颗粒的质量进行控制。