锐钛矿型纳米二氧化钛经口暴露90天对Sprague-Dawley大鼠血常规指标的影响

陈章健，韩 硕，郑 湃，贾 光

(北京大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生学系，北京 100191)

二氧化钛(titanium dioxide，TiO2)在食品领域的应用主要是作为食品添加剂[1-2]，这已经得到了国际食品卫生及食品添加剂主管组织联合国粮农组织、世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会、国际食品法典委员会(Codex Alimentarius Commission，CAC)、美国食品与药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)、欧盟食品安全管理局(Euro-pean Food Safety Authority，EFSA)等的批准，其中美国FDA在2002年认可TiO2为安全物质，对人体并无伤害。中国国家卫生和健康委员会也已正式公布TiO2可用于食品着色剂(GB25577-2010、GB2760-2007)，并详细规定了TiO2的适用范围和最大使用量。

随着纳米技术在农业和食品工业领域的不断开发与应用，纳米材料在食品中的应用也越来越广泛[3]。相对于常规尺度的TiO2，纳米TiO2因其粒径小，具有更多的应用优势，如口感细滑，折光率高、遮盖率强、白色度好等，在食品中的应用急速增加[4]。但是，纳米材料的特殊理化性质使其能在生物体内表现出特殊的生物学作用，甚至可能导致一系列的病理生理改变[5-6]，这必然会导致人们对纳米材料在食品中应用的安全性产生质疑。经口摄入纳米TiO2的安全性研究较少，且多着重于研究其急性或亚急性经口毒性[7-9]。

本课题组前期的研究工作指出，经口暴露纳米TiO230 d能使Sprague-Dawley(SD)大鼠血浆中还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(glutathione/gluta-thione oxidized，GSH/GSSG)的比例明显升高，提示机体产生了还原应激[8]。本研究通过90 d喂养试验，进一步探讨纳米TiO2对SD大鼠血常规指标的影响，以期揭示经口摄入纳米TiO2对血液系统的亚慢性毒性作用，为纳米TiO2在食品领域的安全应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 纳米材料与表征

纳米TiO2购自上海晶纯实业有限公司，纯度为99.9%，晶体结构为锐钛矿，近球形颗粒，平均粒径为(24±5)nm。

1.2 实验动物

雌雄各20只清洁级SD大鼠(3周龄，雌性体质量64～98 g，雄性体质量85～109 g)，购买并饲养于北京大学医学部实验动物科学部[许可证号：SCXK(京)2011-0012、SYXK(京)2011-0039]。适应性饲养1周后，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10只，雌雄各5只。

1.3 大鼠灌胃染毒

采用儿童每日摄入TiO2量(2 mg/kg)作为暴露低剂量[4]，部分参考世界经济合作与发展组织(Organization for Economic Cooperation and Development,OECD)关于啮齿动物重复90 d口服毒性的相关研究指南(Test No.408)进行本次动物实验。将纳米TiO2悬浮于蒸馏水中，使用前超声波分散10 min并涡旋混匀。低、中、高剂量组大鼠分别给予2、10、50 mg/kg纳米TiO2悬液灌胃(前30 d灌胃体积为1 mL/只，后60 d为2 mL/只)，对照组给予同体积蒸馏水，每天上午染毒1次，持续90 d，每天更换新鲜配制的纳米TiO2染毒液。每天观察记录动物的一般情况，每周称重一次。染毒期间未观察到动物异常表现，各组动物体质量无明显差异。动物处死前禁食12 h，不禁水。

1.4 血常规指标检测

染毒90 d后处死动物，取腹主动脉血1 mL以乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)抗凝，采用MEK-6318K全自动血细胞分析仪(日本光电工业株式会社)及相关试剂测定血白细胞(white blood cells，WBC)计数、淋巴细胞(lymphocytes，LYM)计数、单核细胞(monocytes，MOD)计数、中性粒细胞(neutrophil，GRN)计数、LYM%、MOD%、GRN%、红细胞(red blood cells，RBC)计数、血红蛋白(hemoglobin，HGB)含量、平均红细胞血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)、红细胞压积(hematocrit，HCT)、平均红细胞体积(mean corpuscular volume，MCV)、红细胞体积分布宽度(red blood cell volume distribution width，RDW)、血小板(platelet，PLT)计数、血小板压积(platelet crit，PCT)、平均血小板体积(mean platelet volume，MPV)、血小板体积分布宽度(platelet volume distribution width，PDW)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 17.0软件分析，各剂量组的生物学指标先经单样本K-S检验，服从正态分布的数据以均值±标准差表示，各测定指标的多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析，方差齐时组间两两比较采用LSD检验，方差不齐时组间两两比较采用Dunnet’s T3检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况和体质量

如图1所示，纳米TiO2经口暴露90 d期间，大鼠体质量随时间不断增加，表明大鼠处于生长发育阶段，相同染毒时间、不同染毒组雌性和雄性SD大鼠体质量差异无统计学意义，表明纳米TiO2经口暴露对大鼠体质量无明显影响。未观察到染毒期间SD大鼠一般情况出现异常，无死亡病例发生。

A,female rats;B,male rats.图1 纳米二氧化钛经口暴露90 d对SD大鼠体质量的影响Figure 1 Effect of titanium dioxide nanoparticles on body weight of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.2 白细胞相关血常规指标

纳米TiO2可导致SD大鼠WBC及其分类计数的改变(表1)。与对照组相比，雌性大鼠高剂量纳米TiO2染毒组的WBC、LYM、GRN计数均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。雄性大鼠中剂量染毒组的WBC、LYM计数均低于对照组，高剂量染毒组的MOD%明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。各剂量组均为LYM%>GRN%>MOD%，且LYM%和GRN%之和大于95%，但LYM%、GRN%、MOD%在各染毒组大鼠间的差异无统计学意义。纳米TiO2对SD大鼠WBC及其分类计数的影响具有明显的性别差异。

表1 纳米二氧化钛经口暴露90 d对SD大鼠白细胞相关指标的影响Table 1 Effect of titanium dioxide nanoparticles on white blood cell related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.3 红细胞相关血常规指标

纳米TiO2可导致SD大鼠RBC计数及其相关指标的改变(表2)。与对照组相比，雌性大鼠高剂量纳米TiO2染毒组的HGB含量、HCT、RDW均高于对照组；中剂量染毒组RDW明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。雄性大鼠中剂量染毒组HGB含量、HCT、MCV均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。各染毒组大鼠与对照组相比，MCH、MCHC未见明显差异。

表2 纳米二氧化钛经口暴露90 d对SD大鼠红细胞相关指标的影响Table 2 Effect of titanium dioxide nanoparticles on red blood cell related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

2.4 血小板相关血常规指标

纳米TiO2对血小板计数及其相关指标未见明显影响(表3)。

表3 纳米二氧化钛经口暴露90 d对SD大鼠血小板相关指标的影响Table 3 Effect of titanium dioxide nanoparticles on platelet related indicators of SD rats after 90 days of oral exposure n=5)

3 讨论

有研究指出，纳米材料比微米材料更易跨越生物屏障进入血液转运，因此纳米材料可能会对血液系统造成一定的毒作用[5]。Wang等[7]进行的急性经口毒性试验显示，一次经口灌胃5 g/kg纳米TiO2可经胃肠道吸收入血后随血液循环转运至肝、肾、脾、肺、脑等器官，表明纳米TiO2在血液内确实会有一定时间的滞留，因此其很可能会对血液系统产生一定的影响。本课题组前期的研究显示，SD大鼠连续30 d经口暴露0、10、50、200 mg/kg的纳米TiO2[(75±15)nm]能使血浆中的GSH升高，GSSG降低，GSH/GSSG比值升高，表现出明显的还原应激反应[8]。血液系统氧化还原平衡状态的破坏能使其各种功能受到明显影响。Duan等[9]的研究发现，将CD-1(ICR)雌性小鼠暴露于5 nm锐钛矿型TiO2(62.5、125.0、250.0 mg/kg，隔日灌胃染毒30 d)，可在中、高剂量组观察到MHC、HCT、MCV、PLT、MPV、RDW上升，HGB、MCHC、网织红细胞、RBC、WBC、PCT下降，提示TiO2可导致贫血和凝血功能改变。体外实验也发现，纳米TiO2可诱导红细胞氧化溶血[10]。上述血常规指标的变化提示纳米TiO2对血液系统具有一定的损伤作用，而其作用机制可能与氧化还原损伤有关。

以往的研究还处于探讨纳米TiO2高剂量、短时间暴露对血液系统影响的阶段，而纳米TiO2经食物摄入人体应该是一个低剂量、长期暴露的过程，因此，本研究通过连续90 d每日灌胃的喂养试验，探讨经口摄入不同剂量(2、10、50 mg/kg)纳米TiO2的亚慢性毒性试验对不同性别的健康SD大鼠血常规指标的影响，结果显示，纳米TiO2可诱导WBC、LYM、GRN和HGB、HCT、RDW、MCV水平明显改变，但PLT以及其他血小板相关指标均未见明显改变，表明经口摄入纳米TiO2对SD大鼠血常规指标的影响主要集中在WBC和RBC系统，这与王云等[11]进行的30 d经口摄入不同剂量(10、50、200 mg/kg)纳米TiO2对胃溃疡SD大鼠血常规影响的研究结论相符。

本研究发现，纳米TiO2对SD大鼠血常规指标的影响具有明显的性别差异，尤其体现在WBC及其分类计数。与对照组相比，高剂量组雌性大鼠的WBC和LYM均升高，而中剂量组雄性大鼠则下降。纳米TiO2对SD大鼠血常规指标影响的性别差异不仅体现在WBC及其分类计数的变化，还表现出暴露剂量的差别，RBC及其分类计数的变化也体现出这一点，HGB、HCT的明显升高出现于雌性大鼠的高剂量组，而在雄性大鼠中其出现在中剂量组。Wang等[7]的研究结果也显示，急性经口毒性试验中纳米TiO2对CD-1(ICR)小鼠的毒性有性别差异，表现为雌性小鼠在脏器系数以及血生化等指标上比雄性更加敏感。本课题组前期的研究也显示，纳米TiO2经口摄入在诱导肝毒性方面存在性别差异，雌性更加敏感[12]。以往的研究出于简便的目的，纳米TiO2的毒理学动物试验大多使用一种性别的动物[8-9,11]，但根据我们的研究结论，纳米TiO2对机体的毒性作用在性别上可能会有明显差异，因此，如果使用一种性别的动物进行实验，需要注意结论推广时的局限性。

综上所述，亚慢性经口摄入纳米TiO2可引起SD大鼠血常规指标发生改变，并表现出性别差异，但具体的作用机制有待于进一步研究。