甲磺酸去铁胺促进大鼠颅骨临界骨缺损血管化骨再生的早期连续观察

杜文瑜，杨静文，姜 婷

(北京大学口腔医学院·口腔医院，修复科 国家口腔医学中心 国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，北京 100081)

血管化是骨骼生长和发育过程中的关键过程，探索骨缺损部位实现血管化和骨再生的基础数据，在口腔颌面部缺损修复、口腔种植等临床应用中具有一定的指导价值。

一般认为，骨缺损部位往往存在一过性缺氧等生理过程，因而具备了启动血管化的条件，甲磺酸去铁胺(deferoxamine mesylate,DFO)作为一种可促发血管化过程的缺氧模拟药物逐渐受到关注。缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是细胞适应低氧环境的关键性转录因子，是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的异二聚体蛋白质，HIF-1β亚基保持稳定，而HIF-1α亚基在常氧条件下很快被脯氨酰羟化酶(proline hydroxylase,PHD)结构域蛋白降解，在氧水平足够低时，HIF-1α可以维持活性并积累，与HIF-1β结合，诱导下游基因表达[1]。DFO可以通过螯合铁离子[2]对PHD起到抑制作用，从而在常氧环境下维持HIF-1α的活性。DFO在组织移植[3]、皮瓣转移[4]、伤口愈合[5]、糖尿病创伤[6]、心肌缺血[7]等动物模型及临床实验中表现出了促进血管化的能力。

近年来，有学者探讨了DFO在骨再生领域应用的可能，将DFO应用于骨缺损愈合模型，观察到其在血管化和骨再生方面存在着促进效果[8]。然而，在DFO的干预下，骨缺损部位血管化及骨再生存在怎样的变化，包括血管生成的数量如何随时间变化，新生骨组织的量和矿化程度如何随时间变化等问题尚不清楚。本研究旨在通过建立大鼠颅骨临界骨缺损模型，连续观察骨缺损愈合早期的血管生成情况和矿化组织形成情况，初步探索局部施用DFO对骨组织工程中血管化和骨再生的影响，并验证DFO维持HIF-1α蛋白活性的能力。

1 材料与方法

1.1 实验动物、手术及分组

无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级6～8周雄性SD大鼠购于斯贝福(北京)生物技术有限公司，饲养于北京大学口腔医院动物实验室SPF级环境，适应性饲养1周后进行实验。本研究经北京大学生物医学伦理委员会批准(LA2017155)。

A critical size defect of skull was made and the periosteum was kept complete.图1 SD大鼠颅骨临界骨缺损模型Figure 1 SD rats skull critical size defect model

构建30只SD大鼠颅骨临界骨缺损模型(图1)。采用2%(体积分数)戊巴比妥钠腹腔麻醉，备皮消毒后，沿大鼠颅顶纵向切开皮肤，分离皮下组织直达颅骨骨面，暴露手术区域，用直径8 mm的去骨环钻在颅骨上磨刻一圆形印记至颅骨即将穿透，用挖匙轻轻将圆形骨片与下方骨膜剥离，保持骨膜完整，不伤及深层组织，随后分层缝合肌肉和皮肤，大鼠苏醒后放回笼中继续饲养，观察大鼠状态。

将30只大鼠随机分为实验组(DFO组)和对照组，每组15只，实验组大鼠术后第4天于颅骨缺损处局部注射200 μmol/L的DFO溶液300 μL，对照组大鼠局部注射等量生理盐水。两组均分别于术后第5、7、10、14、28天采用二氧化碳过量麻醉法处死3只大鼠，取出颅骨术区标本，以10%(体积分数)中性甲醛溶液固定，逐步进行组织脱钙、脱水、包埋及切片。

1.2 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色

石蜡切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室温下二甲苯脱蜡、梯度乙醇溶液脱蜡至水，苏木素染核5 min后，流水轻柔冲洗2～3 min，用1%(体积分数)盐酸乙醇溶液分化1 s，洗去浮色，氨水返蓝1 min，流水轻柔冲洗10 min，伊红染色1 min，梯度乙醇溶液脱色及脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。

切片均使用Olympus BX51专业数码成像装置及配套专业软件，在40倍、100倍放大条件下观察并拍照(4 140×3 096像素)，组织学观察HE染色切片骨缺损处新生组织和骨断端结合情况。

1.3 Masson骨胶原染色及计量

石蜡切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室温下二甲苯脱蜡、梯度乙醇溶液脱蜡至水，蒸馏水润湿玻片1 min后，使用Masson染色试剂盒内的核染液染核1 min，弃去，冲洗液冲洗30 s，浆染液染色30～60 s，弃去，冲洗液冲洗30 s，分色液作用6～8 min，弃去，复染液染色5 min，弃去，用无水乙醇冲洗，二甲苯透明后，用中性树胶封片。

切片均使用Olympus BX51专业数码成像装置及配套专业软件，在40倍、100倍放大条件下观察并拍照(4 140×3 096像素)。组织学观察Masson染色切片骨缺损处新生组织内部骨胶原分布情况及新生骨组织矿化程度。

对新生骨组织矿化程度使用矿化组织面积(新生骨组织中红染部分)占新生骨组织(红染及蓝染部分)面积的百分比进行定量测量[9]。图像处理主要使用Image J(版本1.52K)软件，对拍摄的100倍放大图片中的旧骨、软组织等非新生骨组织区域进行遮罩剔除后，测算总面积计为a，将彩色画幅转化为灰度8位深度图，取阈值区间(225，255)为白色背景区域，计算面积为b，将彩色画幅转化为RGB(红绿蓝通道)画幅，对红色通道(R)取阈值区间(123，255)为红色和白色的合并区域，计算面积为c。面积计算采用Analyse模块中的Analyse Particles函数计算面积区域，其中，面积阈值为1 μm2至无限大，基于此可计算出：(1)高度钙化的新生骨面积，即图中红染区域面积为c-b；(2)低度钙化或未钙化的新生骨面积，即蓝染面积为a-c；(3)高度钙化占新生骨的比例为(c-b)/(a-b)×100%。

1.4 免疫组织化学染色及计量

石蜡切片于58 ℃烤箱烘烤30 min，室温下二甲苯脱蜡、梯度乙醇溶液脱蜡至水，PBS洗片，3%(体积分数)H2O2室温避光孵育30 min，阻断内源性过氧化物酶活性，PBS洗片，采用酶修复法修复抗原，0.5%(体积分数)胰酶溶液与胰酶稀释液以体积比1 ∶3均匀混合滴加于组织切片上，37 ℃孵育10 min，PBS洗片，将一抗抗体用抗体稀释液以一定比例稀释，将载玻片置于装有蒸馏水的湿盒中，在样本上滴加稀释好的一抗，将湿盒置于4 ℃冰箱过夜孵育。使用CD31一抗抗体标记血管内皮细胞，使用HIF-1α一抗抗体标记HIF-1α蛋白。PBS洗片，向组织上滴加辣根或氢氧化物酶标记的二抗，均匀覆盖全部组织，避光室温孵育30～40 min，DAB显色1～5 min，显微镜下观察控制染色时间，自来水洗，复染，脱水，二甲苯透明后，用中性树胶封片。

组织切片使用Olympus BX51专业数码成像装置拍照。使用Image J软件测量HIF-1α标记的放大200倍的组织切片阳性染色的平均光密度值(average optical density，AOD)，即积分光密度值/测量面积(integrated optical density，IOD/Area)。实验组AOD值参照对照组AOD值的平均值进行标准化处理，即求倍数关系，计为HIF-1α的相对表达量，此时对照组表达量为1。对使用CD31标记血管的放大200倍的组织切片照片计数新生血管数量并进行数据分析。与HE染色切片相比，免疫组织化学染色对于血管计数的敏感性更高，其可清晰识别出仅由2～3个内皮细胞围成的血管样组织，因而可以观察到内皮细胞的迁移聚集、增殖及其血管化等多个阶段。

1.5 统计学分析

使用统计分析软件SPSS 22.0对同一时间点两组间的HIF-1α蛋白相对表达量、血管数量、矿化程度进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DFO促进骨缺损区域血管化

图2为免疫组织化学染色，结果显示骨缺损术后第5天，可观察到骨断端周围软组织内散在的内皮细胞分布，少量微小血管形态已经形成，管径普遍较小，新生血管尚未成熟，实验组缺损间隙内的血管分布比对照组更为密集；术后第7天，两组缺损处可见血管样组织，或为截面直径较小的圆环形，或为顺应纤维组织形态的扁长形，血管壁结构较单一；术后第10天，实验组明显可见内皮细胞环绕形成的血管管腔结构，管径较前增大，部分管腔横截面内可见血细胞分布，新生骨样组织内可见新生血管长入，对照组的血管数量及发生形态均落后于实验组；术后第14天，实验组可见新生血管出现较为完整的管壁内皮细胞环绕，血管形态出现分枝状，管径明显增大，对照组的血管数量及成熟度远低于实验组，同时还发现同一组内从术后第10天至第14天血管数量有减少趋势；术后第28天，实验组可见血管分布较为密集，形态趋于成熟，管径增大，管腔内血细胞分布较多，同时仍可见未成熟新生血管仍在发生，对照组血管分布密度及血管发育成熟程度低于实验组。

Yellow arrow indicates the examples of vascular tissue,“B”marks the defect border or the edge of new bone.DFO,deferoxamine mesylate.图2 CD31标记的血管免疫组织化学染色图像(n=3)Figure 2 Immunohistochemistry staining images of the vessels marker CD31(n=3)

术后血管计数结果也印证了上述发现，术后第5、7、10、14、28天的各个时间节点，实验组新生血管的数量均高于对照组，各时点的两组间差异均有统计学意义(表1)。

2.2 DFO促进骨缺损区域的骨再生及矿化

HE染色(图3A)结果显示，骨缺损术后第5天及第7天，实验组及对照组均可见清晰锐利的骨缺损边界；术后第10天，实验组可见新生骨样组织自缺损边缘向缺损中心方向延伸，并可见骨陷窝及骨细胞，对照组也可见少量新生骨样组织出现；术后第14天，实验组可见成骨区开始改建出现骨髓腔样组织，其新生骨样组织面积多于对照组；术后第28天，实验组新生骨量多于对照组，两组均可见较为成熟的矿化骨组织。Masson骨胶原染色(图3B)结果显示，术后第14天，两组均可见红染的旧骨断端周围出现蓝染的新生骨组织，其间可见红染的矿化程度较高的骨组织呈点状或条状分布；术后第28天，实验组的新生骨量及红染矿化组织面积明显多于对照组，使用矿化组织面积(新生骨组织中红染部分)占新生骨组织(红染及蓝染部分)面积的百分比对新生骨组织矿化程度进行测量和计算，结果见表2。

New bone is circulated by yellow and marked with“NB”.DFO,deferoxamine mesylate.图3 骨缺损区域HE染色(A)及Masson骨胶原染色(B)图像(n=3)Figure 3 HE staining(A)and Masson staining(B)images of the bone defect area(n=3)

表2 实验组和对照组矿化程度的测量Table 2 Measuring of percentages of mineralized tissue area

2.3 DFO短暂维持HIF-1α活性

免疫组织化学染色(图4)结果显示，各组骨缺损区域愈合组织中均可见少量HIF-1α蛋白阳性表达。分析各组HIF-1α蛋白AOD值的相对表达量显示，术后第5天，即局部给予DFO后1天，实验组HIF-1α蛋白的相对表达量显著高于对照组，术后第7、10、14、28天，实验组HIF-1α蛋白的相对表达量略高于对照组，但组间差异无统计学意义(表3)，提示术后第4天局部给予DFO仅可短暂维持HIF-1α活性。

表3 HIF-1α蛋白的相对表达量(倍数)Table 3 Relative expression of HIF-1α(fold change)

Examples of HIF-1α protein expression positively stained in brown is indicated with yellow arrow.DFO,deferoxamine mesylate;HIF-1α,hypoxia inducible factor 1α.图4 HIF-1α蛋白表达(DAB ×200，n=3)Figure 4 Expression of HIF-1α(DAB ×200,n=3)

3 讨论

一般认为，高含量的氧供给和活跃的新陈代谢是新骨生成的必要条件，组织长期处于缺氧状态会出现不愈合或坏死状态，然而，一定程度的缺氧刺激，又能促进血管生成，从而加速骨愈合。目前为止，如何获得可以促进骨缺损愈合的特定缺氧环境尚不清楚，对能发挥缺氧刺激促进作用而又不影响组织新陈代谢的平衡点的相关研究十分重要。近年来，使用缺氧模拟药物(如DFO)在常氧条件下维持HIF活性而不降低组织氧浓度，创造“假性缺氧环境”[10-11]，在骨缺损愈合中的应用研究逐渐受到关注[8,12-13]。本研究探索了局部注射DFO对动物骨缺损模型中血管化和成骨的促进作用。

自然条件下，骨缺损愈合一般遵循以下关键时间点：缺损后约第3天，缺损区域可有纤维细胞和早期血管生成细胞长入[14]；约第5～7天，骨内、外膜增生，新生血管长入；约第10天，软骨开始形成；约第14天，骨折端附近形成的骨样组织逐渐钙化成骨；之后进入骨改建重塑期[15]。新骨生成的早期是血管生成的关键时期，因而本研究选择在缺损处血管增生时期，即缺损术后第4天给予200 μmol/L[12,16]DFO刺激，同时，选择关键时间点，即术后第5、7、10、14天和骨组织再生及重塑后的第28天，观察DFO组和生理盐水对照组的差异。各时间点之间的差异反映了施用缺氧模拟药物后对血管生成及骨缺损愈合进程和效果的影响差别。

组织学观察发现，相同时间点实验组的血管数量和血管组织的形态成熟度均明显优于对照组，提示在SD大鼠颅骨临界骨缺损模型中应用DFO可产生促进血管新生的效果。内皮细胞迁移、增殖和血管化过程由血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)介导[17]，而实现VEGF上调则与HIF的维持关系密切[1]。自然愈合过程中，缺损导致的血肿及炎症造成的局部缺氧环境可能会促进HIF表达，然而，HIF-1α并不稳定，失活较快，对VEGF的上调作用有限，应用DFO则可维持HIF-1α活性，实现对缺氧环境的延长与增效，为上调VEGF表达提供更长的窗口。

DFO组在骨组织再生方面明显优于对照组，提示局部使用DFO不仅加速了成骨过程，相同时间内的成骨强度即矿化程度也得到了优化。DFO对成骨的促进可能来自两个途径：首先，血管化为骨再生提供了重要的物质保障，新生血管不仅供应成骨所需的营养物质，还可递送驻留在血管壁内的干细胞和成骨前体细胞[18]。本研究结果也证实，血管样组织在新生骨结构附近比较集中，充分的营养供应保证了成骨所需良好的微环境，有利于成骨细胞的分化、增生和成熟。其次，血管内皮细胞可通过表达成骨刺激因子为骨组织再生提供刺激及分化可能[19]。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是成骨微环境中的重要信号蛋白，而低氧环境可刺激血管内皮细胞上调BMP-2的表达[20]。此外，BMP-2上调过程中，缺氧的角色，比如缺氧是否为单纯触发条件，或者是BMP-2上调的持续性必要条件，以及DFO能否起到促进内皮细胞上调表达BMP-2的作用，尚值得深入研究。

本研究通过组织学实验验证了DFO维持HIF-1α活性的作用。仅在SD大鼠颅骨缺损术后第5天，也即给药1天后处死的大鼠组织缺损区域，DFO组HIF-1α的表达显著高于对照组，提示DFO维持HIF-1α活性的作用时间较为短暂。结合HIF-1α在血管及新生骨组织生成中发挥的促进作用，若通过增加DFO注射频次可以达到持续延长HIF-1α活性的效果，将有可能延长促进血管化及骨再生的作用。

本研究通过建立SD大鼠颅骨临界骨缺损模型，选用较为安全、微创、可操作性强的局部注射方式给予DFO，观察其对骨缺损愈合早期血管化和骨再生过程的影响，结果显示，早期给予DFO局部注射可增加骨缺损组织愈合中新生血管数量和新生骨组织的量和矿化程度，但如何明确DFO的使用方法以获得骨缺损愈合的最佳缺氧环境尚需进一步研究。本研究也存在局限性，如实验动物样本量较少，可能会存在一定程度上的个体差异影响。本研究初步探讨了DFO对骨缺损区域血管化和骨再生的促进作用，今后的研究中将进一步扩大样本量，可以通过调整DFO使用浓度、给药时间点、给药次数，尝试开发DFO的最优施用方式。本研究结果提示，在骨缺损局部施用DFO可促进缺损愈合，可能具有一定的临床应用价值。