果树脱毒技术研究进展

李亚囡1，李学华1，范婧芳2，王文瑾1，董 辉1*

（1 河北省农林科学院石家庄果树研究所 石家庄 050061；2 河北省植保植检总站）

果树病毒脱毒就是利用一定的技术手段从现有的栽培种质资源中筛选出不带病毒的单株，或利用一定的方法和技术去除植株体内的病毒，从而获得无病毒的果树苗木[1]。目前已报道的脱毒效率较高的技术有：热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、微体嫁接脱毒法、热处理结合茎尖培养脱病毒法及应用病毒抑制剂的化学处理脱毒技术等[2，3]。

1 热处理脱毒技术

热处理脱毒技术是最早研究并应用在果树脱毒处理中的方法之一，并且被普遍使用在果树脱毒中[4]。基本原理是根据病毒和寄主细胞对高温的耐受性存在差异，利用高温处理杀灭或延缓病毒繁殖，抑制病毒在果树组织内的侵染，进而脱除病毒培育出无毒果树[5]，同时对寄主细胞影响较小。该方法工艺简单，对设备要求低，能在较短时间内清除病毒获得无毒植株。在热处理时，需综合考虑不同果树品种的热耐受性以及抑制不同类型病毒复制侵染所需的温度[6，7]，避免在热处理过程中对果树苗木生长造成伤害。以梨树脱毒技术为例，梨树苗在37 ℃环境中处理28 d，可有效脱除矮化病毒、环斑花叶病毒和梨脉黄病毒，但梨树苗木在此过程中也会有高达66%以上的死亡率[8]。此外，该技术对某些种类病毒（如杆状病毒）无效，并且存在脱毒率低、脱毒不彻底等问题，因此该技术在实际生产应用方面有待进一步优化和针对性研究[9]。

2 茎尖培养脱毒技术

病毒在被侵染植物体中的分布不均匀，通常在植株生长点附近的组织中无病毒存在或病毒的含量较低[10]。因此可借助植物组织培养技术，利用果树植株幼嫩组织部分或分生组织为材料进行培养从而得到无毒材料，获得完整的脱毒植株。

由于不同品种果树生长周期及其茎尖分生组织的形态大小各不相同，因此不同果树的茎尖分生组织的获取难度也不同[4，11]。此外，茎尖组织的大小与脱毒率、组织培养成活率直接相关。一般切取的茎尖越小，脱毒的效率越高。例如，利用茎尖培养脱毒技术获得草莓脱毒苗的培养过程中，切取0.1～0.2 mm的茎尖分生组织时，脱毒率为100%；切取0.3～0.4 mm 的茎尖分生组织时，脱毒率为84.5%[1]。但切取0.1～0.2 mm的茎尖分生组织对技术要求极高，即使成功切取分生组织，其分化率和成活率均不高。因此，在进行茎尖培养脱毒时需综合考虑果树品种、脱毒率以及成活率等多方面问题。进一步研究表明，在兼顾成活率和脱毒率的条件下，切取长度为0.2～0.5 mm、带有1～2 个叶原基的茎尖进行茎尖培养脱毒效果比较好[2，6]。

3 热处理与茎尖培养结合脱毒技术

在实际操作中，使用一种脱毒方式往往无法完全脱除病毒，且操作难度大、处理条件要求较高。研究证明，热处理脱毒技术和茎尖培养技术相结合可有效提高脱毒效率[6]，并且还能在一定程度上降低操作难度。以苹果苗木为例，在使用这种复合脱毒技术后，能高效脱除苹果茎沟病毒，其脱毒率高达90%以上[12]。

热处理与茎尖培养结合脱毒的方法主要分为两种[1]：一种是将果树材料先热处理操作，再从处理后的植株上获得茎尖分生组织培养为脱毒植株；另一种是先取相对较大的茎尖分生组织培养，然后对获得的植株进行热处理操作，再取茎尖进行再次分生培养。

4 微体嫁接脱毒技术

微体嫁接脱毒技术是结合组织培养与嫁接技术获得无毒植株的一种新技术[13，14]，切取0.1～0.2 mm 的茎尖材料为接穗，嫁接到试管培养的无毒砧木上，从而培养成为完整的植株。该技术还可有效解决茎尖培养中培养材料诱导生根难的问题。Navarro 等[2]在柑橘植株脱除病毒的研究中应用此技术，植株脱毒率可达80%以上，目前该技术已推广到其它果树品种。

5 化学处理脱毒技术

近年来随着果树脱毒技术研究的不断深入，一些对植物病毒复制、侵染、扩散有一定抑制作用的化学物质被不断发现[15，16]，如抗病毒醚（Ribavirin）、DHT（2，4-dioxohexa-hydro-1，3，5-triazine）等化合物均对植物DNA 或RNA 病毒具有抑制作用[17]。虽然这类物质不能脱除所有病毒，但在茎尖组织培养和原生质体培养过程中加入此类化学物质，能抑制病毒复制[18]，具有一定实用价值。目前，此类化合物对病毒抑制的作用机制和实际应用技术的研究还较为局限，未来需研发出能够应用于实际生产的抗病毒制剂。

6 培育抗病毒植物

Beachy 等[20]借助基因工程技术成功将烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白基因转入烟草中，获得了抗TMV 的烟草，自此以后，通过转入病毒基因而培育出不同程度抗病毒侵染植物的技术多有报道[2]。通过进一步研究整理发现，目前针对果树病毒应用的转基因技术主要有3 种：1）外壳蛋白基因策略。外壳蛋白介导的抗病毒机制目前还不明确，已提出的假说认为外壳蛋白的合成和积累会影响侵染病毒的脱外壳作用和复制[19]，从而达到抵抗病毒的作用。在果树上用此方法抵御的病毒有李痘病毒（PPV）、葡萄铬黄花叶病毒（GCMV）、葡萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄病毒A（GVA）等[6]。2）病毒卫星RNA 基因策略。Ponz 等[1]研究表明，烟草环斑病毒（CLRV）的卫星RNA可抑制CLRV 的复制并减轻CLRV 侵染产生的症状。3）病毒运动蛋白基因策略。病毒在宿主体内长距离移动需要运动蛋白的作用，此策略通过影响运动蛋白合成，限制病毒的系统性移动，从而抑制病毒的扩散。

7 展望

果树病毒稳定性差极易产生变异，随着果树种植面积的不断扩大、果树新品种的不断引进、果树病毒的传播速度呈加快态势，给果树病毒检测和脱毒工作带来了更大的挑战。因而，对于果树脱毒技术和病毒防治的研究也逐渐受到重视。目前，我国己建立了针对危害性较大的主要果树病毒的检测与脱毒技术，但部分脱毒作用的机理还有待进一步研究，现有脱毒技术还有待进一步的改进和完善。此外，我国果树脱毒种苗规模化生产的发展还受到脱毒效率低、种质资源匮乏等因素的制约，因此仍需进一步通过现代生物技术手段提高果树脱毒效率，缩短脱毒周期。