BSEP、MRP2及MDR3在胆管消失综合征患者肝组织表达及与病理形态相关性研究

曹雪改，叶立红，张海丛，王志华，王翀奎

(1. 石家庄市藁城中西医结合医院，河北 藁城 052160；2. 石家庄市第五医院，河北 石家庄 050021；3. 河北中医学院实验中心，河北 石家庄 050000)

胆管消失综合征(vanishing bileduct Syndrome,VBDS)是由于多种因素引起的肝内部分胆管树持续进行性破坏后出现的一种病理形态特征， 当肝穿标本中汇管区小动脉伴行的小叶间胆管消失>50%时定义为VBDS[1]。临床以胆汁淤积为主要表现，长期持续胆管消失、胆汁淤积可导致胆汁性肝纤维化、肝硬化，甚至肝衰竭的发生，是临床中治疗比较棘手的一类疾病。位于肝细胞毛细胆管膜侧上跨膜转运蛋白胆汁酸盐输出泵(BSEP)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)及多药耐药相关蛋白3(MRP3)在胆汁分泌过程中发挥了重要作用。当长期胆管损伤、胆汁淤积时，理论上机体将通过自身调节机制促进负责胆汁分泌的转运蛋白表达，从而缓解长期慢性胆汁淤积的状态。但目前针对BSEP、MRP2及MDR3与VBDS肝病关系的相关研究尚未见报道。因此，本课题观察了BSEP、MRP2及MDR3在VBDS患者肝组织中表达及分布特点，分析三者表达强弱与VBDS不同病理形态之间的关系；从而探讨影响胆汁分泌的跨膜转运蛋白在VBDS患者肝组织中的表达变化及作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 采用回顾性研究方法，收集2010年1月—2019年12月在石家庄市藁城中西医结合医院和石家庄市第五医院经肝穿组织病理明确诊断为VBDS患者85例，患者均有碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)水平升高，排除各型病毒感染、原发性硬化性胆管炎、化脓性胆管炎、大胆管梗阻、缺血性胆管损伤、a-抗胰蛋白酶缺乏症、Caroli病、肝移植后排异反应等。根据引起VBDS病因不同分为药物性肝损伤引起的VBDS组(D-VBDS)和原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cirrhosis，PBC)引起的VBDS(P-VBDS)组，其中D-VBDS组42例，均有明确的用药史；P-VBDS组43例，同时伴AMA、AMA-M2阳性。同时选取15例无胆管消失的乙肝携带者作为对照组。本研究方案经石家庄市第五医院伦理委员会审批(SJZWY2020018)，所纳入患者均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器 免疫组化试剂盒(PV-6000)、DAB显色液、抗体稀释液购自北京中杉金桥试剂公司， BSEP(ABCB11)鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，MRP2(ABCC2) 兔单克隆抗体、MDR3(ABCB4)兔多克隆抗体购自美国Abcam公司，主要仪器为Image-Proplus6.0(IPP)图像分析软件、美智Powerlmager Version5.3图像采集系统及OLYMPUS BX53显微镜。

1.3研究方法 详细收集所有入选病例的一般资料(年龄、性别)、血清学指标等，对肝组织进行病理观察，记录肝细胞淤胆、毛细胆管淤胆、小叶内炎症、小胆管损伤、细胆管增生、汇管区炎症6项病理形态特点并进行半定量评分，观察 D-VBDS组和P-VBDS组患者肝组织中 BSEP、MRP2、MDR3免疫组化阳性表达特点，并与对照组进行对比分析；同时分析 D-VBDS组和P-VBDS组间不同病理形态与BSEP、MRP2、MDR3评分之间的相关性。

1.3.1肝组织常规病理检测 患者均在超声引导下经皮肝穿刺活取材，肝穿刺标本长度>1．0 cm。肝穿标本均进行连续切片，常规进行苏木素-伊红(HE)染色、网状纤维+Masson染色、淀粉酶消化过碘酸希夫法染色(D-PAS)、CK7/CK19免疫组化染色。病理形态观察及半定量评分由两名高级职称病理医师共同进行。

1.3.2肝组织BSEP、MRP2、MDR3免疫组化检测及结果判定 石蜡切片脱蜡至水，免疫组织化学染色严格按照SP法操作，一抗BSEP、MRP2及MDR3以适当比例(BSEP 1∶500、MRP2 1∶300、MDR3 1∶600)稀释滴加， PBS 代替第一抗体作为阴性对照。BSEP、MDR3、MRP2均表达于肝细胞毛细胆管膜侧，因此免疫组化染色以在肝细胞胆管膜上出现棕黄色为阳性表达，无着色为阴性表达。

1.3.3肝组织病理形态学半定量评分 根据相关指南及文献[2]， 选取上述6项病理形态作为观察指标，制定总分为18分的病理评分系统，并对每项病理指标根据病变程度进行半定量评分。

1.3.4肝组织BSEP、MRP2、MDR3半定量评分所有切片图像采集均在完全相同显微镜条件下拍摄，并对图像分析软件设定统一选色参数。应用软件分别测量BSEP、MRP2、MDR3在每张切片的阳性区域面积、平均光密度值、积分光密度值(integrated optical density，IOD)，IOD=阳性区域面积×平均光密度值。测量得到IOD数据作为半定量分析的有效指标。

2 结 果

2.1性别及年龄构成 D-VBDS组42例，女33例(78.6%)，男9例(21.4%)；发病年龄9～68(52.4±11.7) 岁，其中<40岁12例，40～50岁15例，>50～60岁10例，>60岁5例。P-VBDS组43例，其中女35例(81.4%)，男8例(18.6%)，发病年龄29～72(51.3±12.8) 岁，其中<40岁6例，40～50岁17例，>50～60岁12例，>60岁8例。2组性别构成上均是女性多于男性，差异无统计学意义(P>0.05);2组发病年龄比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，均以40～50岁年龄段最多见。

2.2BSEP、MRP2、MDR3表达特点及半定量评分BSEP、MRP2、MDR3特异性定位于肝细胞毛细胆管膜，在对照组沿肝细胞毛细胆管膜侧呈微管状阳性表达。D-VBDS组、P-VBDS组中BSEP、MRP2、MDR3在肝细胞毛细胆管膜侧阳性表达均明显增强，表现为沿毛细胆管膜阳性线性表达较对照组明显增粗，有的呈分支状或小凝块状；D-VBDS组、P-VBDS组 BSEP、MRP2、MDR3评分均明显高于对照组(P均<0.05)，但D-VBDS组和P-VBDS组间BSEP、MRP2、MDR3评分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1 D-VBDS组、P-VBDS组及对照组肝组织中 BSEP、MRP2、MDR3免疫组化IOD均值方差分析比较

2.3BSEP、MRP2、MDR3 评分与不同病理形态评分相关性 D-VBDS组、P-VBDS组中 BSEP、MRP2、MDR3评分均与小胆管损伤及细胆管增生呈正相关性，表现为细胆管增生越明显、小胆管损伤越重，BSEP、MRP2、MDR3阳性表达越强；其他病理形态特征与BSEP、MRP2、MDR3间均无相关性(P均>0.05)。见表2。

表2 D-VBDS组与 P-VBDS组BSEP、MRP2、MDR3评分与不同病理形态评分的相关性

3 讨 论

VBDS最早被称为肝内胆管缺乏，是近几年来逐渐被重视的慢性胆管性疾病，以胆汁淤积、胆管减少为主要特点[3]。实验室检查碱性磷酸酶和谷氨酰转肽酶明显升高，也可出现高直接胆红素血症和转氨酶轻度升高。由于该病主要累及终末小胆管，影像学检查常无特异性改变，因此肝活检是诊断胆管损伤、消失和明确病因的重要手段[4]。VBDS的病因可能与发育异常、代谢和免疫学异常、感染、药物等多种因素相关[5]，其中免疫性和药物性因素是临床引起VBDS最主要的两种病因。因此本研究重点以免疫性PBC引起的VBDS和药物性引起的VBDS作为观察分组对象。既往研究显示，胆汁由肝细胞分泌是一个需要主动耗能的排泌过程,行使该功能主要依靠肝细胞毛细胆管膜侧上的3种跨膜转运蛋白BSEP、 MRP2和MDR3来共同完成[6-7]，其参与的胆汁排泌是胆汁流形成的关键限速步骤[8]。这3种转运蛋白为ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族成员，其表达异常是多种疾病中胆汁淤积的“原发事件”[9]。研究显示，BSEP通过ATP的水解将胆盐逆浓度梯度泵入毛细胆管,形成毛细胆管内胆汁酸盐依赖性胆汁流[10]。BSEP基因的表达异常可引起进行性家族性肝内胆汁淤积症2型(PFIC2)和良性复发性肝内胆汁淤积症2型(BRIC2)[11]。MRP2是唯一将结合胆红素从肝细胞内转运至毛细胆管内的转运蛋白[12]，MRP2基因突变或缺失则引起Dubin-Johnson 综合征。MDR3为卵磷脂转运蛋白，能有效将磷脂从双分子层膜内侧移至外侧膜，与胆盐和胆固醇形成混合微粒，防止胆盐对胆管上皮细胞的毒性损伤。其表达水平降低会使胆汁中卵磷脂含量下降，胆盐不形成微胶粒，从而降低胆固醇的溶解度[13]，导致胆管上皮细胞的损伤破坏。3种转运蛋白在急性淤胆性肝病及遗传代谢性肝病中的表达特点已有研究报道，但尚未见到3种转运蛋白在慢性淤胆性肝病，特别是VBDS中的表达变化。因此本研究观察了三者在VBDS患者肝组织中表达及分布特点，分析三者表达强弱与不同病理形态之间的关系，以期探讨影响胆汁分泌的跨膜转运蛋白在VBDS的表达变化特点，并观察不同的病理形态改变是否与三者的表达有相关性。

首先通过对 D-VBDS组与 P-VBDS组在性别及不同年龄段构成比较显示，2组间年龄比较差异无统计学意义,2组在性别构成上均是女性多于男性，提示不论是PBC引起的VBDS还是药物性损伤引起的VBDS，均是女性更容易发生，这是由于女性对药物的敏感性高于男性， 同时PBC也以女性更多见有关。但2组在不同年龄段例数比较差异亦无统计学意义(P>0.05)，2组均以中年女性为主，且以40～50年龄段例数最多见，提示性别及年龄为慢性胆汁淤积的两大危险因素。研究认为，高龄患者药物代谢酶细胞色素P450活性降低、药物清除率及肝代偿功能下降、基础性疾病等多种因素有关[14]，从而增加胆管损伤及胆管消失的发生风险，并且更多地进展为胆汁淤积性肝损伤[15]。

本研究结果还发现，虽然D-VBDS组与 P-VBDS组引起VBDS的病因不同，但是2组与正常对照组比较，3种转运蛋白在肝细胞胆管膜侧阳性表达均明显增强，表明小胆管损伤消失引起肝内慢性胆汁淤积，机体在长期慢性淤胆的刺激下，促进了肝细胞毛细胆管膜上的3种转运蛋白的过表达，通过增加转运蛋白的合成分泌以期达到促进胆汁排流的目的，从而发挥代偿调节作用。该研究结果也进一步证实当长期慢性胆管损伤消失、胆汁淤积时，机体将通过自身调节机制促进负责胆汁分泌的转运蛋白的表达，从而起到缓解长期慢性胆汁淤积的状态。同时，3种转运蛋白在不同病因引起的VBDS肝组织中的表达变化均较一致， 证明病因不是影响转运蛋白表达的重要因素，不同病因所引起的共同的胆管损伤消失、慢性胆汁淤积的病理形态学改变才是造成跨膜转运蛋白过表达的主要因素。同时通过对比分析3种转运蛋白表达与不同病理形态之间的相关性发现，3种转运蛋白组化评分与细胆管增生及小胆管损伤呈正相关性，均表现为细胆管增生越明显、小胆管变性损伤越重，转运蛋白阳性表达越强；其他病理形态特征与3种转运蛋白间均无相关性。进一步从病理形态学角度证实，细胆管增生及小胆管变性损伤两种形态改变是启动3种转运蛋白过表达的病理组织学基础，也是反映慢性胆汁淤积的主要病理指标，而其他病理学改变则非重要因素。

本研究显示，不同病因引起的VBDS可继发引起肝细胞毛细胆管膜侧BSEP、MDR3、MRP2的过表达，并从形态学上寻找到细胆管增生及小胆管损伤是与之相关的病理改变，进而为全面认识VBDS提供了更加客观的研究依据，对明确导致慢性胆汁淤积的损伤位点进而有针对性地合理用药具有重要意义。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。