翠冠梨果实采后病原菌分离鉴定及室内毒力测定

李树成，王印宝，赵显阳，吴 帆，肖刘华，陈 明，陈金印，2，向妙莲

(1 江西农业大学农学院/江西省果蔬采后处理关键技术与质量安全协同创新中心/江西省果蔬保鲜与无损检测重点实验室，南昌，330045；2 萍乡学院，江西萍乡，337055)

翠冠梨PyruspyrifoliaNakai cv. ‘Cuiguan’为蔷薇科(Rosaceae)梨属(Pyrus)植物，具有良好的营养价值和栽培性能[1]，是江西省早熟梨的主要栽培品种。翠冠梨的适宜采收期为7月中旬，此时正处于高温多雨的盛夏，环境潮湿闷热，加之采摘、运输过程中易摩擦碰撞受损，产生微创口，有利于病菌的侵染，导致果实在贮藏期间发生软化腐烂，造成严重的经济损失[2]。侵染采后梨果实的病原菌种类多样，研究报道，酥梨[3]、库尔勒香梨[4]和白梨[5]等梨的采后病原菌包括葡萄座腔菌Botryosphaeria、扩展青霉菌Penicilliumexpansum、链格孢菌Alternariasp.和炭疽菌Colletotrichumfructicola等。

目前，江西地区翠冠梨果实采后病害的研究较少，本实验室首次报道了由层出镰刀菌Fusariumproliferatum[6]和美澳型核果褐腐病菌Moniliniafructicola(另文发表)引起的翠冠梨果实腐烂病。为继续明确引起采后翠冠梨果实腐烂致病菌，本文对江西省翠冠梨采后病害病原菌进行分离鉴定，同时使用不同药剂对病原菌进行室内毒力测定，以期为翠冠梨采后病害的防治提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

翠冠梨果实采摘自江西省峡江县金坪乡果园，后贮藏于4～5 ℃冷库，在贮藏期间采集发病果实，用于病原菌分离。

基因组DNA快速制备试剂盒：购自上海博彩生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒：购自康宁生命科学有限公司。

供试杀菌剂(原药)：50%肟菌酯(Trifloxystrobin)、95%粉唑醇(Flutriafol)、95%己唑醇(Hexaconazole)、95%复硝酚钠(Compound Sodium Nitrophenolate)、95%苯醚甲环唑(Difenoconazole)、95%恶霉灵(Hymexazol)、96%戊唑醇(Tebuconazole)和25%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)，由江西农业大学农学院植物保护系农药实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化

参考方中达[7]的方法，翠冠梨病果经75%乙醇表面消毒后去除病部果皮，取病健交界处果肉，采用组织分离法分离病菌，再进行单孢纯化，置-80 ℃保存，活化后待用。

1.2.2 致病性检测

梨果实经75%乙醇消毒，用无菌接种针刺破果皮形成约3 mm深伤口，注入1.0×106个孢子/mL的悬浮液10 μL，以等量无菌水为对照。将接种梨果实置于28 ℃恒温箱内(湿度95%)，逐日记录梨果实发病情况。

1.2.3 病原菌形态学鉴定

将已纯化的病原菌接种在PDA培养基上，28 ℃恒温培养5～7 d，根据菌落特征、菌丝形态，分生孢子颜色、大小等，参考真菌鉴定手册等[8-11]，对采后翠冠梨病原菌进行形态学鉴定。

1.2.4 病原菌分子生物学鉴定

病原菌DNA的提取。将新鲜菌丝体刮取置于灭菌研钵中，加液氮研磨成粉，用基因组DNA快速制备试剂盒提取待鉴定病原菌基因组DNA，于-20 ℃保存。

扩增引物序列。用真菌通用引物ITS1/ITS4(ITS1，5＇-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3＇；ITS4，5＇-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3＇)扩增菌株的rDNA-ITS序列[12]。

PCR扩增体系与程序。PCR扩增50 μL体系：ITS1(10 pmol/L)0.8 μL；ITS4(10 pmol/L)0.8 μL；DNA模板2 μL；10x PCR buffer 5 μL；ddH2O 36.9 μL；dNTP mix 4 μL；r-Taq 0.5 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性6 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。30个循环后72 ℃延伸8 min。PCR完成后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收纯化，产物由苏州泓迅生物科技有限公司进行测序。

ITS序列分析。利用DNAstar软件分析菌株rDNA-ITS测序结果，登陆NCBI进行同源性比对分析。

1.2.5 室内毒力测定

采用生长速率法[13]测定不同药剂对链格孢菌Alternariagaisen和粉红单端孢菌Trichotheciumroseum菌丝生长的抑制作用。使用无菌水将待测药剂按有效成分分别配制成所设浓度的母液，按1∶9比例将母液混入溶解冷却至45 ℃左右的PDA培养基中，制成试验所需浓度的含药平板，以加等量无菌水作为对照。用直径6 mm的灭菌打孔器，从菌落边缘切取菌饼接种至平板中央，每处理3次重复，置于25 ℃培养箱培养5～7 d后采用十字交叉法测量菌落直径。抑菌率计算公式：抑制率 =[(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/(对照组菌落直径)] ×100%；

采用牛津杯法[14]测定不同药剂对扩展青霉Penicilliumexpansum的抑制作用。用0.9%氯化钠溶液配制浓度为1.0×106个孢子/mL的孢子悬浮液，将孢子悬浮液按1∶9比例均匀混入冷却至45 ℃左右的PDA培养基中，制成含菌平板。在平板中央放置一个直径8.0 mm的牛津杯，注入200 μL药液，以等量无菌水作为对照，每个处理重复3次，置于25 ℃恒温培养箱中培养3 d，采用十字交叉法测量抑菌圈直径。抑菌率计算公式：抑制率=[(处理组抑菌圈平均直径)/(培养皿直径-对照组抑菌圈平均直径)]×100%。

1.2.6 数据处理

利用SPSS 22.0对数据进行统计分析，应用最小二乘法，建立“质量浓度对数-几率值”的直线方程，其中因变量(y)为抑菌率换算而成的几率值，而自变量(x)为试验药剂浓度对应的对数值，并分别得出各供试药剂的EC50值和其相关系数R2。

2 结果与分析

2.1 病原菌的形态学鉴定

2.1.1 链格孢菌形态学鉴定

链格孢菌在生长初期呈灰白色，后逐渐转为黑褐色，菌丝致密，气生菌丝丰富，菌落中央质地紧实，呈毡状，凸起且泛白，菌落生长速度为15.6 mm/d(图1D)。分生孢子棍棒形、卵圆形或梨形，浅褐色至黑褐色，有2～5个隔膜，基部有锥形或柱形短喙，大小约(16.4～28.8)μm ×(4.3～15.6)μm(图1E)。

2.1.2 扩展青霉菌形态学鉴定

扩展青霉菌生长迅速，初期菌落菌丝紧密，正面呈白色，背面为黄色至黄褐色，生长后期菌落表面形成粉末状青绿色霉层，产生大量分生孢子(图1F)。分生孢子梗无色有帚状分支，分生孢子单孢无色，球形或卵形，大小为(2.7～3.0)μm ×(3.1～3.5)μm(图1G)。

2.1.3 粉红单端孢菌形态学鉴定

粉红单端孢菌在生长初期菌落呈白色或淡粉色，菌丝绒毛状，培养第3 d左右转为粉红色，产生大量分生孢子使菌落呈现出粉质状(图1H)。分生孢子单生，无色，倒梨形或长圆形，不等大双胞，分隔处稍有缢缩，孢子基部有喙状突出，大小约(8.9～27.5)μm × (6.1～12.2)μm(图1I)。

2.2 病原菌分子生物学鉴定

用rDNA-ITS引物对分离得到的病原菌的ITS区进行PCR扩增。将电泳后的条带凝胶回收，送至苏州泓迅生物科技有限公司测序，获得的序列大小分别为566、539和613 bp，将所测得序列提交至NCBI GenBank进行BLAST同源性分析，发现病原菌分别与链格孢菌(基因登录号EU520123.1)、扩展青霉菌(基因登录号KT316700.4)及粉红单端孢菌(基因登录号KP317992.1)同源性为100%，序列与ITS扩增结果相同。

2.3 致病性测定

将纯化后的链格孢菌、扩展青霉菌和粉红单端孢菌回接至健康梨果实，测定其致病性(图1)。结果表明：3种菌株均能引起翠冠梨果实发病，病部与初分离时病果症状一致。再次分离回接发病病果上的病原菌，得到与接种菌株特征一致的菌株。

注：A、B、C分别为链格孢菌、扩展青霉菌、粉红单端孢菌致病性测定结果；D、E分别为链格孢菌菌落及孢子；F、G为扩展青霉菌菌落及孢子；H、I为粉红单端孢菌菌落及孢子。

2.4 室内毒力测定

2.4.1 不同杀菌剂对链格孢菌室内毒力测定

试验结果看出，不同杀菌剂对链格孢菌菌丝生长表现出不同抑制效果。其中95%己唑醇对链格孢菌抑制效果最好，EC50值为0.519 μg/mL；95%戊唑醇、95%苯醚甲环唑、95%复硝酚钠、95%恶霉灵效果次之，EC50值分别为1.972、2.390、11.106、16.244 μg/mL；50%肟菌酯的抑制效果最差，EC50值为1 197.806 μg/mL。比较毒力回归方程斜率可知，链格孢菌对6种杀菌剂的敏感性依次为：95%己唑醇>95%戊唑醇>95%苯醚甲环唑>95%复硝酚钠>95%恶霉灵>50%肟菌酯(见表1)。

表1 不同杀菌剂对链格孢菌室内毒力测定

2.4.2 不同杀菌剂对粉红单端孢菌室内毒力测定

试验结果可以看出，不同杀菌剂对粉红单端孢菌的抑制效果有比较明显的差异。6种供试杀菌剂中，95%戊唑醇和95%恶霉灵对粉红单端孢菌的毒力作用最强，其EC50值分别为2.351、3.393 μg/mL；95%苯醚甲环唑、95%复硝酚钠、50%肟菌酯、95%己唑醇的抑制效果次之，EC50值分别为8.041、11.772、14.100、16.442 μg/mL。粉红单端孢菌对6种杀菌剂的敏感性依次为： 95%戊唑醇>95%恶霉灵> 95%苯醚甲环唑> 95%复硝酚钠> 50%肟菌酯>95%己唑醇(见表2)。

表2 不同杀菌剂对粉红单端孢菌室内毒力测定

2.4.3 不同杀菌剂对扩展青霉菌室内毒力测定

试验结果看出，6种供试杀菌剂对扩展青霉菌的抑制效果差异显著，EC50值在100 μg/mL以内的药剂为25%吡唑醚菌酯、95%己唑醇、95%戊唑醇；95%苯醚甲环唑、95%粉唑醇、50%肟菌酯的EC50值均大于100 μg/mL。扩展青霉菌对6种杀菌剂的敏感性依次为：25%吡唑醚菌酯>95%己唑醇> 95%戊唑醇> 95%苯醚甲环唑> 95%粉唑醇> 50%肟菌酯(见表3)。

表3 不同杀菌剂对扩展青霉菌室内毒力测定

3 结论与讨论

多种病原菌的侵染是导致果蔬贮藏期间腐败变质的主要原因，适宜条件下，病原菌侵入果实内部大量生长繁殖，掠夺寄主营养并分泌有害代谢物，致使果实腐败变质[15]。近年来，梨果实在贮藏期间发病愈加严重，因此明确引起病害的病原菌种类，对梨采后病害的防治至关重要。前人研究报道了在不同地区由链格孢菌[16]、扩展青霉菌[17]和粉红单端孢菌[18]分别引起雪英梨、香梨和早美酥梨果实采后病害。本项目组以江西省峡江县翠冠梨果实为试验材料，根据柯赫氏法则，通过形态学和分子生物学方法，并进行致病性测定，首次报道了由层出镰刀菌[6]引起的翠冠梨果实腐烂病以及美澳型核果褐腐病菌(另文发表)。基于此，本研究进一步明确了引起采后翠冠梨果实腐烂的病原菌为链格孢菌、扩展青霉和粉红单端孢菌。

江西省梨果实采后病害种类复杂，药剂防治是有效控制梨果实病害的重要途径之一。本试验选用不同杀菌剂对链格孢菌、扩展青霉和粉红单端孢菌进行了室内毒力测定。对链格孢菌的室内毒力测定中， 95%己唑醇、95%戊唑醇、95%苯醚甲环唑对链格孢菌的抑制效果最好，其EC50值分别为0.519、1.972、2.39 μg/mL，与高小宽等[19]的研究结果一致。6种杀菌剂对粉红单端孢菌毒力测定显示，95%戊唑醇、95%恶霉灵的毒力最强，有较好的抑制作用；此外，朱亚伟等研究表明，50%多菌灵、70%甲基托布津对梨果实粉红单端孢菌也有较强的抑制效果[18]。不同杀菌剂对扩展青霉菌的毒力测定表明，25%吡唑醚菌酯、95%己唑醇、95%戊唑醇对其生长抑制作用较明显；张时馨等[20]把临床药物应用到对梨果实采后青霉病的防治中，发现成本低廉的联苯苄唑对扩展青霉菌的抑制效果较好，将传统药剂开发成为防控采后病害的新用途。

本文鉴定了引起翠冠梨果实采后病害的3种主要致病菌，并测定了不同杀菌剂对上述病原菌的毒力，为防治翠冠梨果实采后腐烂病提供了一定的理论参考。由于室内毒力试验受多种因素的制约，不同杀菌剂在翠冠梨果实贮藏实践的防病效果有待后续试验进一步验证。