寒兰CONSTANS-LIKE基因表达水平及光周期响应分析

应震，周庄，杨燕萍，付双彬，徐碗

(浙江亚热带作物研究所，浙江 温州 325000)

寒兰(CymbidiumkanranMakino)植株修长优美，花色丰富，香味清醇，具有极高的观赏价值、经济价值和文化价值，为五大国兰之一，广泛分布于我国东部、南部及日本和朝鲜半岛，在东亚具有悠久的栽培历史和广泛的种植基础。通过实地调查发现，在浙江地区，寒兰无论种植于室内还是室外，其花期主要集中于10—12月，偶有寒兰会于春季和夏季开花，花期总体上具有一定的周期性。

随着分子生物学研究的发展，植物光周期调控开花的分子机理在拟南芥上逐渐揭示，叶片COL基因对光周期响应是植物光周期开花的根本原因[1]。通过深入研究，以COL和FT基因为核心调控元件的光周期调控的开花模型已经在很多植物开花研究中得到了验证[2]。在蒺藜[3]、菊花[4]、李子[5]、山茶[6]和棉花[7]等植物中已克隆得到对应的FT和COL基因及其同源基因。研究发现，在模式植物中过量表达FT基因可以明显缩短植物花期；而过量表达COL基因可以明显上调FT基因的表达水平，同样起到缩短花期的功能。

寒兰作为五大国兰之一，花期与大多数兰花存在不同，本文拟通过对寒兰开花的统计分析以及利用已报道的兰属、石斛属[8]和蝴蝶兰属[9]COL基因家族信息，对寒兰COL基因在花期前后表达水平进行分析，拟为下一步开展光周期调控寒兰的开花系统研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料及采样

寒兰种植于浙江亚热带作物研究所温室大棚中，定期浇水培养，选择生长健壮的植株进行实验，实验开展时间为5—11月，每第一个月第一周，采集10盆寒兰叶片，叶片采集并液氮处理后超低温冰箱保存。

待植株开花后按照是否开花进行样品分类，并提取RNA，建立cDNA文库。

1.2 荧光定量引物设计

通过现有蝴蝶兰和兰属已报道的COL基因序列，结合课题组已有寒兰转录组数据，采用bioedit软件进行比对，获得两条相似性较高的寒兰COL转录组序列(c112049.graph_c0和c110006.graph_c0)分别命名为CKMCOL1和CKMCOL2。采用NCBI Primer BLAST在线设计荧光定量引物，筛选得到2对荧光定量引物(COL1-F：TGTTC GCAGGTGTCCTCATC，COL1-R：CGCGTAGCGTAT CGTCTTCT；COL2-F：CCCTTCAAATGGCGCAACAG，COL2-R：AGCGAACCGCCCTTTAATCC)。以ACTIN为内参基因，引物为ACTIN-F：ATGCTCCCAGGG CTGTATTC，ACTIN-R：TACCCCTTTTAGACTGCGCC。

1.3 COL表达水平检测

采用1.2设计的引物，对采集的样品进行荧光定量分析，比较两组之间表达水平差异。

2 结果与分析

2.1 花期前后寒兰COL基因表达水平分析

通过图1可以看出，无论是否开花，寒兰COL1基因在5—7月表达水平都逐渐上升，而8—11月，开花组寒兰的COL1基因表达水平先快速上升再缓慢下降，与未开花组寒兰相比，均呈显著和极显著差异，由此可见，COL1基因在叶片中的特异性表达与寒兰开花有密切联系；而7月开始，光照时间缩短，但温度较高，因此，推测COL1基因可能参与FT基因的调控，同时也能响应温度变化。

*—开花组和未开花组之间差异显著，P<0.05；**—开花组和未开花组之间差异极显著，P<0.01。

由图2可知，COL2基因无论在开花组和未开花组，在5—8月都呈现表达水平上升的趋势，而9—11月呈下降趋势，与植株开花并无明显关联，这说明COL2基因的功能可能是响应温度的变化。

图2 COL2基因在开花和未开花植株间表达水平

2.2 COL基因对光暗的响应

图3显示，COL1基因在光处理3 h时，表达水平呈现略上升趋势，但无显著性差异，而在暗处理条件下，COL1基因随着处理时间延长表达水平上升，在3 h时，显著高于对应的光处理条件。由此可以推断COL1基因既能够响应温度变化，同时也能响应光照变化。

图3 COL1基因在光暗处理下表达水平

图4显示，寒兰COL2基因在光暗处理条件下的表达水平变化，可以看出，无论光处理还是暗处理，COL2基因表达水平变化基本相等，并无明显的上升和下降，因此，可以推断COL基因不能响应光周期的变化。

图4 COL2基因在光暗处理下表达水平

3 讨论

COL基因家族在植物中对环境因子进行响应并且对下游的植物生理现象进行调控，这其中包含了花期调控。本研究通过转录组大数据筛选，得到了寒兰的COL1和COL2基因，其中COL1基因不仅具有显著的光周期调节特性，同时也能对温度变化进行响应，与寒兰花期存在相关性；而COL2基因则具有温度响应的特性，与花期并无显著相关性。为了继续深入探究寒兰COL基因家族的功能，今后需要结合拟南芥等模式植物的转化技术和转录组大数据分析，对其基因功能进行更加深入的了解。