互花米草根际耐盐促生菌的筛选及功能研究

冀小草，钱兰华，张羽，沈雪林，许亚男，吴天惠，熊吟荷，黄彦才，王桃云*

(1.苏州科技大学 化学与生命科学学院，江苏 苏州 215009；2.苏州农业职业技术学院，江苏 苏州 215008；3.苏州市种子管理站，江苏 苏州 215011)

土壤盐渍化已成为一个严重的世界性环境问题，在干旱和半干旱地区尤为严重[1]。自然条件下造成土壤缓慢盐渍化的原因主要有2个：一是风化过程岩石的破坏导致各种可溶性盐类的释放；二是海洋季风与降雨中的盐分沉积。同时，人类的一些不合理的生产活动也加剧了土壤的盐渍化，如不合理的开荒、以一年生的作物代替多年生的植被及使用盐水进行灌概或排水不及时等[2]。目前全球盐碱地面积已达10.0亿hm2，我国盐碱地面积约1.0亿hm2，而且盐碱地面积正逐年增加[3]。土壤盐渍化会降低农作物产量、牧草品质与林木成活率，从而危及农业、牧业和林业的可持续发展，破坏生态系统自我调节能力，进而导致社会经济发展失衡[4-5]。在人口逐年增加、耕地逐年减少的情况下，盐碱地问题已经成为制约我国农业发展的重要因素，开发利用盐碱地具有重大战略意义[6]。

目前，对盐碱地改良及修复的方法主要有以下3种[7]：转基因植物及遗传选育的开发利用；水土工程措施；利用微生物改良盐碱地减轻盐胁迫对作物的危害。转基因植物及遗传选育的方法操作要求高、耗时长，并受到道德和环境等因素约束，难以推广；水土保持工程的方法虽然有一定效果，但也存在耗资巨大、难以大面积推广的问题；利用土壤微生物进行盐碱地改良，具有成本低、无污染、能大范围推广的优势，而且土壤微生物对盐碱地作物具有促生活性、增强盐碱地作物耐盐生长能力的作用。因此，有关根际微生物耐盐促生的功能活性研究受到广泛关注。

互花米草(SpartinaalternifloraL.)是为了保滩护岸、促淤消浪而从国外引种的草本植物。它对气候、环境的适应性和耐受能力很强，是一种典型的盐生植物[8-9]。

本研究从互花米草根际土壤筛选具有耐盐促生作用的植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)，并对筛选出的优势耐盐菌株的耐盐促生性能及其对黄瓜的耐盐促生作用进行研究。以期为改良和修复盐碱土、促进盐碱土作物生长提供新策略，并初步探讨互花米草适应海滩高盐环境的机理。

1 材料与方法

1.1 样品采集

土样采自江苏省南通市启东吕四镇的海边滩涂互花米草根际，土壤采样深度为20 cm，采得的根际土壤经风干、粉碎后过100目筛待用。

1.2 主要药品试剂与培养基

1.2.1 主要药品

琼脂粉、胰蛋白胨、酵母提取物、铬天青S、氢氧化钾、氯化钠、牛肉浸膏、葡萄糖等均购自上海国药化学试剂有限公司。三氯化钼、溴百里香酚蓝L-色氨酸、D-(+)-Mallc acid(苹果酸)、抗坏血酸、3-吲哚乙酸(IAA)、VH等均购自阿拉丁(上海)生化科技有限公司。

1.2.2 主要培养基

LB培养基、WA培养基、NA培养基、NFb培养基、无机磷培养基(NPA)、有机磷培养基(OPA)、NFM培养基、胰蛋白胨水培养基、葡萄糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、SIM培养基、明胶培养基、淀粉培养基等。

1.3 耐盐菌株的分离筛选

土壤菌株分离纯化。取处理好的土样，按钱兰华等[10]方法进行菌株分离纯化，然后接种于LB斜面培养基并在4 ℃冰箱中保存备用。

菌株耐盐能力测定。参照Patel等[11]的方法，对菌株耐盐能力进行测试。

耐盐菌株ACC脱氨酶活力测定。参照赵龙飞等[12]所述方法测定菌株粗酶液中α-丁酮酸含量，并进一步参照Saleh等[13]的方法测定菌株ACC脱氨酶比活力，其酶活力单位为U·mg-1·h-1。

1.4 优势耐盐菌株Y3的各种促生能力测定

Y3菌株产IAA能力测定。参照Wichner[14]和吴翔[15]的方法，通过受试菌株能否使反应液变红来判断菌株是否具有产IAA能力。

Y3菌株固氮能力的测定。依据杨敬辉等[16]的方法测定Y3的固氮能力，通过受试菌株能否使培养基变蓝来判断其是否具有固氮能力。

Y3菌株解磷能力测定。参照Ribeiro[17]和Piromyou[18]所述方法，测定Y3菌株的解磷能力，根据受试菌株能否在NPA、OPA平板上形成透明圈判断其是否具有解磷能力。

Y3菌株产嗜铁素活性的检测。参照Machuca等[19]所述方法，通过检测受试菌株能否在CAS平板上形成橘黄色晕圈来判断菌株是否具有产嗜铁素活性。

Y3菌株产NH3能力测定。参照康贻军等[20]的方法，根据受试菌能否将反应液由褐色转为黄色来判断其是否具有产NH3能力。

菌株赋值评估。根据以上促生能力测试结果，参照杨敬辉等[16]的方法对耐盐优势菌Y3的促生潜力进行赋值评估，判定Y3菌株的促生潜能。

1.5 Y3菌株适宜生长条件确定

利用比浊法在600 nm波长下测试盐浓度、温度、pH、光照以及培养方式对Y3菌株的影响，得到Y3菌株的适宜生长条件。

1.6 菌株鉴定

Y3菌株的生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》[21]和《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)[22]。

Y3菌株分子生物学鉴定参照杨新等[23]所述方法，对Y3菌株的总DNA进行提取，然后进行PCR扩增，对扩增产物进行测序后，将得到的序列在NCBI数据库中用BLAST与己知序列进行同源性比对，然后利用软件MEGA 5.0构建系统发育树。

1.7 Y3菌株对黄瓜种子发芽的促生试验

参照钱兰华等[10]所述方法，测试Y3菌株对盐胁迫下黄瓜种子发芽的促生作用，测定黄瓜种子的发芽率、鲜重和干重，并进行比较和分析。

1.8 数据分析

采用Excel 2010作图，SPASS 19.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 耐盐菌株分离筛选

从互花米草根际土壤中共分离筛选出6个耐盐菌株，分别命名为Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6。6个菌株的耐盐实验结果(表1)表明，Y3和Y6的耐盐性能比其余4种菌株要强。同时，菌株的ACC脱氨酶活性结果显示Y3菌株的ACC脱氨酶活性最强，达到0.61 U·mg-1·h-1(表2)。由各菌株耐盐实验和ACC脱氨酶活性实验结果可知，Y3菌株的耐盐能力和ACC脱氨酶活性都优于其余5个耐盐菌株，因此，选择Y3菌株进行后续研究。

表1 不同培养基平板中菌落数

表2 不同菌株的ACC脱氨酶比活力

2.2 Y3菌株促生能力

通过对Y3菌株的固氮、解磷、产嗜铁素、产IAA、产氨等促生能力进行测试，对耐盐优势菌Y3的促生潜力进行赋值评估，发现Y3菌株对于所进行的6种促生能力测试均呈阳性(表3)。因此，Y3菌株有这6种相应的促生性能，具有很好的促生潜能。

表3 Y3菌株促生潜力

2.3 Y3菌株适宜生长条件

通过测定不同盐浓度、温度、pH、光照以及培养方式对Y3菌株的影响，发现Y3菌株适宜以振荡的方式进行暗培养，具体适宜生长条件是盐浓度6%、温度30 ℃、pH 4.0(图1)。

图1 不同培养条件对Y3菌株生长的影响

2.4 Y3菌株的鉴定

2.4.1 生理生化特性

Y3菌株为杆状，芽孢椭圆；菌落近似圆形，乳白色、不透明、中央隆起有褶皱，边缘呈锯齿状。其生理生化特性鉴定结果见表4。

表4 Y3菌株的生理生化特性

2.4.2 Y3菌株分子生物学鉴定

通过对Y3菌株的16S rDNA的基因测序，并进行遗传进化分析，得到系统发育树(图2)。菌株Y3的16S rDNA序列与Bacillusmethylotrophicus同源性最高，结合该菌株的生理生化特性，鉴定菌株为芽孢杆菌属的甲基营养型芽孢杆菌。

2.5 Y3菌株对黄瓜种子发芽的促生作用

Y3对黄瓜种子发芽的促生效果如表5所示。纯水+Y3菌液组的黄瓜种子发芽效果最好，盐水组即盐胁迫对照组的黄瓜种子发芽效果最差。盐水+Y3菌液组的发芽率、根长、芽长、鲜重及总干重比盐水组均有所增加，其中发芽率、根长、芽长、鲜重差异均达到显著水平。

表5 Y3菌株对黄瓜种子发芽的促生效果

3 小结与讨论

本研究通过耐盐及ACC脱氨酶活性测定，从互花米草根际土壤中分离筛选出6个耐盐促生菌株，从中选出Y3菌株进行进一步深入研究。通过形态观察、生理生化特征以及16S rDNA测序鉴定出Y3菌株为甲基营养型芽孢杆菌。其适宜培养条件为盐浓度6%、温度30 ℃、pH 4.0，并以振荡方式进行暗培养。Y3菌株能显著促进盐胁迫下黄瓜种子的发芽率及幼苗的生长，盐+Y3菌液组的发芽率、根长、芽长、鲜重及总干重比盐水组均有所增加。Y3菌株具有较强的产IAA、产嗜铁素、产NH3能力和固氮能力。

研究表明，Y3菌株能在较高盐浓度环境中生长良好，并具有多种促生潜能，因此，Y3菌株在改良盐碱化土壤、缓解设施农业土壤盐碱化问题及高盐发酵工业等方面具有应用潜力，在农业中具有较好的开发应用价值。通过驯化或基因工程手段提高Y3菌株的耐盐和促生活性及稳定性，并将其应用于农业生产中，提高作物耐盐能力是今后进一步研究的重点。

另外，根据本研究结果，我们推测互花米草具有的强耐盐抗逆能力，或许与其根际土壤中的耐盐促生菌的耐盐促生作用有关联，这有待于后续进一步探索研究。