CRISPR-Cas9技术原理及其在猪的应用研究新进展

房元杰，张晓爱，魏文康*，刘春朋

（1．仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州510225；2．广东省农业科学院农业生物基因研究中心，广东广州510640）

基因编辑（gene editing，Ge）是能够更准确地改变生物基因组内特定目标基因的新基因工程技术，指人为操作基因组的特定碱基插入、缺失或替换的行为，也被称为基因组编辑。20世纪80年代，Thomas等[1]将外源DNA序列整合到哺乳类动物基因组的特定部位，成功修复碱基变异，并删除DNA序列，由此开启人工改变生物基因组的历程。现在，基因编辑技术作为重要工具在生物医学领域发挥着重要作用。

传统的基因编辑技术依赖机体自发的同源重组修复机制，打靶效率低、操作烦琐[2]，需要对随机集成的基因组进行解决、置换或变更。因此，传统的基因编辑技术无法满足现阶段的需求。集群规律间隔回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相关蛋白（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，Cas）的出现[3]弥补了传统基因编辑技术的缺点。Cas蛋白家族中，Cas9蛋白因设计制造简单、高速、高效、低成本等优势，被快速和广泛使用，成为科学研究和医疗等领域的有效工具。

猪是重要的农业经济动物，CRISPR-Cas9技术在活体猪中的应用不仅有助于提高猪的生产和繁殖性能，还有利于编辑和改良猪品种。

1 CRISPR-Cas9技术发展历程

1987年，科研工作者发现大肠杆菌基因组IAP基因有特殊的重复间隔序列存在。2000年，研究人员发现大多数古菌、细菌以及线粒体基因组中均有规则重复间隔序列，并命名为规则短回文间隔重复序列（short regularly spaced repeats）[4]。2年后，Jansen等[5]发现，原核生物基因组中有新的重复序列，根据该重复基因座家族的结构特性，将其命名为规律成簇的间隔短回文重复序列。Barangou等[6]在噬菌体试验中，首次证实原核细胞的适应性免疫系统，并发现噬菌体DNA能被crisprRNA特异性断裂。2012年，美国伯克利实验室研究员Jenik等[7]把crRNA-tracrRNA复合物简洁化，改造成嵌合体单链结构，即向导RNA（guide RNA，gRNA）。

2014年，Wu等[8]把CRISPR-Cas9技术应用在哺乳动物细胞上进行基因组结合，并纯化CRISPR及CRISPR相关蛋白技术。2017年，Abudayyeh等[9]研究表明，Cas酶可特异性降低哺乳动物细胞中RNA水平。哈佛大学Vikram等[10]在动物细胞基因组编辑程序中对天然蛋白质Cas9进行修饰，获得一种新的Cas酶Cas9。该酶是具有更高DNA特异性Cas9突变体。随着基因编辑技术不断完善，高效且高特异性Cas9蛋白变体的数量库不断增长，促使基因组编辑技术发展更加迅速。

2 CRISPR-Cas9技术原理及功能

2.1 CRISPR-Cas9技术原理（见图1）

由图1可知，CRISPR-Cas9编辑技术由内切酶靶向位点切割生物基因组使DNA双链断裂（double strand break，DSB）。DSB在细胞内的修复方式为同源重组（homologous recombination）和非同源末端连接（nonhomologous end joining）。其中，非同源末端连接的修复机制主要发生于真核生物[11]，通过核苷酸的插入或缺失，不需要同源序列即可重新连接DNA游离末端，进而实现基因敲除的目的[12]。当同源序列存在时，DSB区间大概率发生同源重组，进而定点敲入或编辑基因[13]。

2.2 CRISPR-Cas9系统功能

CRISPR-Cas系统存在于绝大多数古生菌和近半细菌中，对外源性病毒和质粒入侵有着天然的免疫防御机制[14]。目前，CRISPR-Cas系统应用最为广泛的是来自产脓链球菌的Ⅱ型系统，即CRISPR-Cas9系统。该系统的构成为重复序列和间隔序列；重复序列高度保守，上游有前导序列（leader sequence），前导序列引导集群间隔短回文序列转录成非编码CRISPR RNA（crRNA），crRNA与反式激活RNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）结合形成复合物。CRISPR-Cas9系统工作原理（见图2）。

CRISPR-Cas9系统由CRISPR序列和Cas9基因构成，CRISPR序列又包括前导序列、重复序列和间隔区。由图2可知，该系统主要概括为3个过程，分别为适应、表达和干扰[15]。外源物质入侵机体时，外源物质颗粒的小段脱氧核糖核苷酸序列会整合到宿主基因组的前导序列和重复序列之间，跟随宿主DNA复制，生成新结构[6]。在表达过程中，首先把CRISPR基因组转录成一段长链RNA，即CRISPR RNA前体；Cas蛋白则生成复合物，该复合物执行内切酶的功能，将crRNA特异性切割并加工成成熟的crRNA；加工后的crRNA和Cas蛋白结合形成复合体，在干扰过程中发挥其功能[4]。当外源物质颗粒再次接触宿主时，crRNA与同源外源核酸序列自然结合，复合体将外源核酸切割成碎片，保护宿主免受侵害[6]。

3 CRISPR-Cas9技术的应用

3.1 CRISPR-Cas9技术在育肥猪生产中的应用

育肥猪自然状态下生长缓慢、瘦肉率低，难以达到要求，可采用基因编辑技术修饰生长相关基因来改变当前状态。

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）是一种抑制肌细胞生长的蛋白，由动物肌细胞天然产生。MSTN不仅能够抑制骨骼肌细胞的增殖和分化，还能够决定肌肉纤维的数量，是影响肌肉生长和瘦肉率的主要代谢抑制因子。车东升等[16]利用CRISPR-Cas9技术在猪胚胎成纤维细胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs）中诱导非同源末端连接，通过体细胞核移植技术和胚胎移植技术获得MSTN突变仔猪。结果表明，双心MSTN基因猪骨骼肌纤维越多、瘦肉率越高。

可选择标记基因（selectable marker gene，SMG）是动物体内源基因，该基因可能干扰引入基因的正常表达，并使宿主对抗生素产生耐药性，对整体性能产生不利影响。2016年，Bi等[17]利用CRISPR-Cas9和Cre-LoxP重组方法，敲除猪原代细胞中MSTN的特定等位基因KO，并使用Cre重组酶从等位基因KO中删除SMG，并制备无标签MSTN基因克隆猪。western-blot检测结果发现，基因克隆猪MSTN蛋白表达量大幅下降，肌肉中相关基因表达效果显著增强。

2017年，Zheng等[18]采用CRISPR-Cas9介导非同源重组整合外源片段，利用SCNT和ET技术构建KI基因特异性编码解偶蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）修饰猪，使UCP1小鼠基因在白猪脂肪组织中特异性表达。研究结果表明，UCP1基因能降低脂肪合成、提高瘦肉率。KI-UCP1突变猪具有胴体率高、脂肪沉积少的优点，生产含KIUCP1基因的突变猪能够改善热调节、增强仔猪在寒冷环境中产热能力，提高仔猪存活率，降低低温对生猪生产造成的经济损失，为人类提供健康优质的猪肉及其副产品。

3.2 CRISPR-Cas9技术在抗猪繁殖与呼吸综合征中的应用

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and repiratory syndrome virus，PRRSV）引起的只感染猪并引起母猪妊娠流产，仔猪和育肥猪肺炎的急性传染病。2007年，Jay等[19]研究表明，CD163基因是PRRSV的细胞融合受体。PRRSV入侵细胞的关键结构域为SRCR5，由PRRSV的第7个外显子编码组成。为进一步研究CD163基因结构功能，韩晓松等[20]针对猪CD163基因第6和第7个内含子分别设计成对sgRNA，构建sgRNA成对表达载体；敲除CD163基因关键结构域SRCR5序列，构建SRCR5删除的大白猪胎儿成纤维细胞；利用体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术成功制备了CD163 SRCR5缺失突变猪，为后续研究猪抵抗PRRSV奠定基础。2017年，Christine等[21]研究发现，CD163 SRCR5缺失依然能在巨噬细胞表面正确表达，表明SRCR5能清除血红蛋白-结合珠蛋白的特性。为验证SRCR5缺失猪巨噬细胞对PRRSV的感染情况，该团队制备敲除CD163 SRCR5基因修饰猪，删除CD163第7个外显子，得到特定编辑质粒转染PK-15细胞，显微注射至猪受精卵胞质，获得外显子7缺失仔猪。结果显示，CD163 SRCR5删除编辑猪能完全抵抗PRRSV，并保留该基因的生物学功能。2019年，Guo等[22]制备出敲除SRCR5中LBP（Ligand-binding pocket，LBP）的基因修饰猪。

3.3 CRISPR-Cas9在抗猪传染性胃肠炎上的应用

猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起仔猪呕吐、脱水为特征的高度传染性疾病。2019年，Luo等[23]采用CRISPR-Cas9技术破坏猪传染性胃肠炎病毒中的一个假定受体氨基肽酶-N（APN），成功获得了APN基因失活猪。后续试验研究结果显示，APN失活猪能正常存活和繁殖，新生仔猪对高致病性传染性胃肠炎病毒有抗药性；经过组织病理学分析发现，肠道中的胃肠炎病毒未引起APN失活猪肠道病变，但野生型仔猪小肠出现典型病变；免疫化学分析表明APN失活猪肠道组织中未发现传染性胃肠炎病毒抗原。经过病毒感染试验测试证明，APN失活猪能有效抵抗TGEV。

3.4 CRISPR-Cas9在抗非洲猪瘟中的应用

非洲猪瘟（African swine fever，ASF），一种由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的烈性传染病。自该病暴发以来，国内养猪业遭受巨大的经济损失。2018年，科研人员通过转染编码Cas9质粒和sgRNA引导非洲猪瘟病毒CP204L基因密码子71向78改性，并以此得到野猪肺（WSL）细胞系，发现靶向Cas9能使病毒基因组裂解，并降低病毒量[24]。同年，Borca等[25]以猪巨噬细胞作为细胞基质，从高致病性毒株Georgia07基因中敲除非必需基因8-DR，获得重组病毒，为将来疫苗研发奠定基础。

3.5 CRISPR-Cas9技术在器官移植上的应用

异种移植间的超免疫排斥主要难题是α-GAL和non-GAL抗原，它们负责调节机体体液超敏反应。2014年，Li等[26]通过敲除猪体内与免疫排斥反应相关、在人体中已自然消失的基因，减轻异种器官移植带来的排斥反应。同年，Masahiro等[27]破坏猪A-1，3-半乳糖转移酶基因（GGTA1），使α-GAL表位合成受阻，降低了超急性排斥反应的发生概率。Chuang等[28]在敲除GGTA1基因的小型猪进行相关基因编辑得到3种突变猪biallelic mutant pig（bMt）、monoallelic mutant pig（mMt）、non-mutant pig（nMt）。该团队研究人员对3种突变猪外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）细胞毒性测定，发现bMt pig的PBMC存活率最高，达到80%，PBMC存活率越高，超免疫排斥反应越小。2017年，高景波[29]对GGTAL1敲除的巴马小型猪再破坏猪β1，4N-乙酰半乳糖胺转移酶基因（β1，4N-acetylgalactosaminyl transferase，β1，4NGalNT2）,该基因编码的蛋白能够引起异种移植排斥反应，减少因异种移植排斥反应带来的影响。

异种移植除受免疫排斥反应的干扰，猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retroviruses，PERV）的难题亟须解决。2015年，Yang等[30]使用CRISPR-Cas9技术整合Cas9编辑酶到猪基因组中诱导猪内源性逆转录病毒逆转录酶基因突变，抑制PERV复制。2017年，Niu等[31]敲除猪体内所有PERV基因，使得猪内源性逆转录病毒传播的风险降低。同年，Yang等[30]与云南农业大学魏红江教授合作研究显示，猪细胞中的PERV能够感染人细胞并传染体外的人体细胞。为清除异种器官移植过程中内源性病毒跨种传染的风险，研究人员采用CRISPR-Cas9技术结合细胞凋亡相关抑制剂、生长因子制备出PERV灭活的原发性猪细胞系、胚胎以及活猪。PERV灭活猪能够提供更安全、有效的器官，以解决器官供应短缺的问题[30]。有研究人员采用crispr-cas9技术删除猪胚胎中关键器官形成基因，创造遗传“空位”，并将人诱导性多潜能干细胞（human induced pluripotent stem cell，HIPSC）注射至猪胚胎中，成功培养出含人体细胞的猪胚胎。张玄等[32]研究敲除PERV，同时敲除3种主要异种抗原并敲入9种人源化基因，获得肾脏、肝脏、心脏，建立猪-猴异种器官临床研究模型，结果表明，猪在克服超急性排斥反应、缓解体液排斥反应以及凝血紊乱上比较有优势，但能否作为临床异种器官移植供需体仍有待进一步研究。

4 展望

CRISPR和CRISPR相关蛋白技术，自2013年首次被应用于乳腺细胞，在短时间内得到较快发展，推动生物医学领域大量研究，已成为当今世界上应用最广泛的基因编辑技术。与传统的选择性技术相比，CRISPR-Cas9技术优势明显，可对特定基因进行编辑操作，短时间内即可获得目的基因。CRISPR-Cas9技术可提高猪的生产性能，缩短繁殖周期，带来良好的经济效益。由于控制活猪的基因多且复杂，想通过改变特定的基因序列使它们的表型显著体现仍有困难。近年来，养猪业遭受各种猪病的冲击，CRISPR-Cas9技术能够更好地了解分析病毒，对各类疾病的防控具有重要作用。CRISPR-Cas9技术促进了对动物的生命活动规律、重大疾病的发生和发展的了解，为器官移植提供理论参考和技术保障。随着CIRSPR-Cas9技术的不断完善和发展，该技术在猪基因组编辑中的应用对生物科学界具有更多的价值与意义。