NLRP3炎性小体与妊娠相关疾病*

冯晓玲， 姜天悦， 张 杨△

1黑龙江中医药大学附属第一医院妇科二科，哈尔滨 150040 2黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040

炎性反应是机体常见的生理、病理活动，是一种因潜在有害刺激而启动的防御反应[1]。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体作为宿主先天免疫系统的促炎因子，是具有双重作用的多蛋白复合物，响应多种外源性病原微生物和内源性应激相关信号分子，通过炎性反应和细胞死亡机制发挥先天免疫调节作用[2]，清除病原体，维持机体稳态，但是过度活化的NLRP3炎性小体会导致多种疾病。在生殖生物学背景下，NLRP3炎性小体在人类子宫内膜和胎盘中大量表达，与早产(preterm delivery,PTD)、复发性流产(recurrent spontaneous abortion,RSA)、子痫前期(preeclampsia,PE)等疾病的病理生理过程有很强的相关性[3]。

1 概述

1.1 NLRP3炎性小体的构成和功能

固有免疫是机体抵御外来入侵的第一道防线，主要通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，例如胞外Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)和胞内NOD样受体(NOD-like receptor，NLR)，激活相关炎症信号通路，诱导炎症反应而启动防御机制[4]。部分PRR可以募集下游的接头蛋白形成炎性小体复合物，促使白细胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和IL-18等炎性介质成熟、分泌，发生炎症反应。目前，对于NLRP3炎性小体的研究最为广泛[5]。

NLRP3炎性小体是高分子量胞内多蛋白复合物，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和pro-Caspase-1组成。NLRP3可在各类激动剂的作用下募集ASC，通过ASC结合pro-Caspase-1形成NLRP3炎性小体。活化的NLRP3炎性小体将pro-Caspase-1剪切为具有生物活性的半胱天冬酶-1(Caspase-1)。Caspase-1既可裂解IL-1β和IL-18的前体，促进其成熟与分泌，也可裂解Gasdermin D蛋白(GSDMD)引起细胞焦亡[6]。病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)和危险相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMP)信号都可以诱导NLRP3炎性小体活化。因此，NLRP3炎性小体一方面可识别病毒、细菌等病原微生物，辅助抵御外来威胁；另一方面可识别内源危险信号，例如胆固醇结晶、尿酸盐结晶、高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein，HMGB1)、细胞外碎片，细胞外囊泡和游离脂肪酸等，在消除机体异常状态的过程中发挥重要作用[7]。NLRP3炎性小体活化失调的影响已经在关节炎、心血管疾病和代谢综合征的发病机制中得到证实。近年研究发现，NLRP3炎性小体在人类母胎界面的异常激活参与了多种妊娠综合征，特别是不明原因复发性自然流产(URSA)、PTD和PE的病理机制[8]，说明以NLRP3炎性小体为靶标的干预治疗可能是改善妊娠相关疾病预后的一种有效手段。

1.2 NLRP3炎性小体的活化机制

NLRP3炎性小体主要在巨噬细胞和树突状细胞中表达[5]。目前研究认为NLRP3炎性小体的活化机制主要有3种：一是活性氧(ROS)增加。研究发现，多种NLRP3炎性小体活化剂可引起线粒体损伤，导致线粒体ROS增多[9]，乙酰半胱氨酸作为ROS抑制剂，能大幅减少细胞内Caspase-1表达和IL-1β的释放。而且，NLRP3炎性小体的激活可同时募集NLRP3和ASC组分蛋白向线粒体迁移，说明了线粒体损伤、ROS增加在NLRP3炎性小体激活过程中的重要作用[10]。二是钾离子外流，也被认为是炎性小体活化的早期信号。提高胞外钾离子的浓度，可抑制NLRP3炎性小体活化；使用不含钾离子的培养液，诱导胞内钾离子外流可以诱导NLRP3炎性小体活化，说明NLRP3炎性小体的活化过程伴随钾离子外流[11]。三是溶酶体破碎。研究显示，大的结晶样物质被巨噬细胞内吞后，因无法被降解导致溶酶体损伤或破碎，释放组织蛋白酶B进入胞质，可导致NLRP3炎性小体的活化[7]。另外，除了钾离子外流，Ca2+和Cl-的流动，NIMA相关蛋白激酶7也参与了NLRP3炎性小体的活化过程[12]。目前认为NLRP3炎性小体活化的经典途径包括2个阶段[13]：首先，在激活之前，NLRP3在大多数类型细胞中启动,核因子kB刺激脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可上调NLRP3和IL-1β mRNA表达，使NLRP3和pro-IL-1β蛋白表达升高;之后，通过NLRP3的泛素降解促进NLRP3炎性小体的快速诱导[14]。

2 NLRP3炎性小体与妊娠相关疾病

炎症是机体对有害刺激物(例如病原体，受损或死亡细胞以及刺激物)复杂的保护性免疫反应，受到机体的严格调节，使组织在感染或受损后能够存活并保持稳态。从母体免疫系统的角度来看，胚胎作为半同种异体组织易受到母体排斥。然而在生理妊娠中，绒毛外滋养细胞在适度的促炎环境下，侵入子宫黏膜并与各种母体免疫细胞直接对话，形成免疫耐受。免疫炎性反应所介导的组织生长、重塑和分化过程对于维持妊娠至关重要，而异常炎性反应与多种妊娠并发症相关联[15](图1)。有证据表明，NLRP3炎性小体在PTD患者的绒毛膜、RSA患者的子宫内膜和PE患者的胎盘中过表达[16]。

2.1 早产(PTD)

PTD定义为在妊娠37周前分娩，是全球围产儿发病和死亡的主要原因，发病率约为10%，其中70%为自发性早产(其余为医源性早产)。目前自发性早产公认的诱因是羊膜内炎症(intra-amniotic inflammation，IAI)或感染[17]。IAI可由微生物(细菌、病毒或真菌)感染引发。Gomez-Lopez等[18]研究发现，与没有胎盘病变的早产女性相比，取自自发性早产女性的绒毛膜羊膜、急性绒毛膜羊膜炎的组织，表达更高浓度的炎性小体组分(Caspase-1，Caspase-4，ASC/CASP-1复合体，IL-1β，IL-18)。Faro等[19]以LPS诱导建立IAI动物模型，观察发现,在发生早产之前NLRP3炎性小体己在转录水平启动，表现为炎性小体相关基因(Caspase-1，IL-1β)mRNA的表达增强，并且胎膜和基蜕膜中NLRP3蛋白水平升高。体内使用特定的NLRP3抑制剂MCC950治疗后，降低了IAI引发的早产和新生儿死亡率。研究发现，在自发性PTD妇女的绒毛膜提取物中，HMGB1的浓度高于足月自然分娩的妇女。HMBG1属于警示蛋白家族，它的释放发生在炎性小体组装和Caspase-1激活的下游，当组织受到感染或损伤时，活化免疫细胞和受损细胞将HMGB1释放到细胞外空间，成为一种促炎介质。研究表明，在绒毛膜中孵育HMGB1可上调炎性小体NLRP3的mRNA和蛋白表达，并诱导成熟Caspase-1和IL-1β的释放，说明HMGB1对NLRP3的激活起正反馈作用[20]。可见，NLRP3炎性小体的激活参与了感染诱发PTD患者绒毛膜的先天免疫炎性反应。

然而，大多数自发性早产合并羊膜内炎症的病例是在没有微生物侵扰的情况下发生的[21]，提示炎症可能源自坏死或细胞应激产生的内源性危险信号，即由DAMP激活NLRP3炎性小体诱发“无菌”炎症[8]。研究人员借助超声引导在妊娠小鼠羊膜内注射警报蛋白S100B，引发了较高的早产率(50%)和新生儿死亡率(59.7%)。采用多重细胞因子阵列和免疫印迹分析发现，S100B引起羊膜腔内促炎反应，诱导胎膜NLRP3炎性小体激活，表现为NLRP3蛋白上调，活化Caspase-1和成熟IL-1β的释放增加。通过特异性抑制剂MCC950抑制NLRP3炎性小体，可将早产率降低35.7%，新生儿死亡率降低26.7%[22]，证明危险信号分子激活NLRP3炎性小体，参与了非感染相关PTD的发病机制，也为针对无菌性羊膜内炎症可通过靶向NLRP3炎性小体进行干预提供了证据。

2.2 不明原因复发性自然流产(URSA)

RSA是指连续2次或2次以上与同一性伴受孕且在孕20周之前自然流产，在妊娠女性中的发病率约为3%～5%。RSA病因复杂，除已知的解剖学、内分泌、基因、免疫和感染等因素外，仍有约40%的病例无法解释病因，也称为URSA。母胎界面抗炎和促炎因子的平衡在形成免疫耐受、维持妊娠中发挥重要作用，URSA与异常的免疫和炎症反应有关[23]。在URSA女性的子宫内膜组织中，NLRP3炎性小体表达显著增加，呈Caspase-1依赖性分泌IL-1β和IL-18。因此，NLRP3炎性小体可能代表一个新的子宫内膜容受性标记蛋白家族。炎性小体异常激活，参与了非容受性子宫内膜的分子机制，导致孕早期胎儿丢失[24]。虽然IL-1β对母胎免疫耐受的形成和产前子宫颈成熟具有重要作用，但IL-1β在绒毛和蜕膜中的过量表达容易诱发不良妊娠结局[25]。研究人员利用LPS刺激，在URSA患者绒毛与蜕膜组织中激活炎性小体，发现NLRP3炎性小体在URSA组织中的表达明显高于无并发症自愿选择中止妊娠的对照组。过度活化的NLRP3炎性小体可介导母胎界面异常的炎症反应，造成滋养细胞活力降低，迁移和增殖能力不足，使胚胎着床困难，导致妊娠失败。而且，炎症状态下的滋养细胞可通过增强巨噬细胞的M1型(促炎)功能，进一步扩大母胎界面的炎症反应[26]。另外，Tersigni等[27]发现URSA患者肠道通透性异常升高，并检测到更高的血浆LPS(NLRP3炎性小体的强力激活物)水平，认为URSA女性肠道细菌成分可能进入母体循环，激活NLRP3炎性小体，引起广泛的促炎细胞因子分泌，当脆弱的子宫内膜组织受到感染时，可出现免疫反应失调，引发URSA。生理妊娠中母胎界面的细胞和分子处于免疫平衡状态，当Th17/Treg、Th1/Th2平衡状态被打破并倾向于促炎症状态时，母体和胎儿会产生相互排斥，最终导致胎儿丢失[28]。Lu等[29]研究表明，URSA患者外周血单核细胞和蜕膜组织中NLRP3炎性小体的表达与CD4+IL-17A+水平呈正相关，而与CD4+CD25+Treg细胞呈负相关。URSA小鼠模型也显示类似的结果。使用Caspase-1抑制剂YVAD后，检测URSA小鼠CD4+IL-17A+和CD4+CD25+Treg水平，结果表明，YVAD治疗后CD4+CD25+Treg水平升高，CD4+IL-17A+水平下调，提示激活的NLRP3炎性小体通过调节Th17和Treg之间的平衡，参与了URSA的发病机制。

2.3 子痫前期(PE)

PE是指妊娠20周后出现高血压伴蛋白尿的综合征[3]。目前学者认为PE的核心病理机制是胎盘形成不良，血液灌注不足，使炎性因子和细胞碎片释放入血，母体出现全身炎性反应和内皮功能障碍[30]。在探寻PE病理机制的过程中，Mulla和Xie等[31-32]率先提出NLRP3炎性小体的异常激活与PE相关。之后，多项研究证明PE女性样本中NLRP3及相关介质(如Caspase-1，IL-1β，IL-18，TNF-α和HMGB1)的表达显著升高[33-34]。

研究发现，PE的病因——胎盘发育不良与NLRP3炎性小体参与的滋养细胞焦亡密切相关[28]。细胞焦亡是具有促炎和细胞溶解性质的新型细胞程序性死亡途径，是机体应对感染的免疫防御机制，但是过度细胞焦亡引发的异常炎性反应和免疫细胞大量死亡，会使宿主免疫功能严重受损[35]。在早发PE分娩的胎盘组织、正常人类滋养细胞(暴露于低氧、内质网应激源)，以及PE患者血清中，均检测到焦亡相关炎症标记物Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18表达增加。实验证明，慢性病理刺激(如缺氧)引起过度内质网应激，过度激活未折叠蛋白反应，提高了硫氧化还原蛋白相互作用蛋白(TXNIP)水平，随后触发NLRP3炎性小体激活，增加活性Caspase-1的生成，将IL-18/IL-1β前体和GSDMD前体分别裂解为成熟IL-18/IL-1β和GSDMD的N端片段(NT-GSDMD)。NT-GSDMD易位至质膜并形成膜孔，释放包括DAMP在内的细胞内容物，使组织出现无菌炎症[36]。Chen等[37]发现PE胎盘合胞滋养细胞微囊泡和纳米囊泡进入母体循环，在体外试验中显示可发挥促炎、抗内皮和促凝活性。这些微粒可以作为DAMP，诱导炎性小体超活化，导致过度的炎症状态。Kohli等[38]进行的小鼠研究显示，小鼠内皮衍生的胞外囊泡可致胎盘血管床内活化血小板积累。这一现象与胎盘NLRP3炎性小体血小板依赖性激活有关，引发了PE样表型。不仅如此，胎盘炎性小体激活的遗传和药理学抑制都解除了PE样表型，说明胞外囊泡诱导的炎性小体激活是妊娠综合征发病机制的一个中心机制，并揭示了一种新的母胎界面血栓炎症机制。Stødle等[39]证实，补体成分C5a等因子的初始活化可促进NLRP3炎性小体对结晶胆固醇和尿酸的反应，并诱导IL-1β在发生炎症的PE胎盘合胞体滋养细胞中过度加工，发生胎盘炎症。可见，多种内源性DAMP，如胆固醇、尿酸结晶、细胞外DNA、HMGB1蛋白、细胞外细胞碎片、游离脂肪酸和晚期糖基化终末产物在PE患者外周血和胎盘中过表达，并成为母体血清和(或)应激胎盘组织内NLRP3炎性小体的激活剂[39-40]。

3 靶向干预治疗前景

NLRP3炎性小体异常激活可通过多种途径影响女性的生殖健康和妊娠结局。针对NLRP3炎性小体的治疗和管理方法可能有助于改善此类疾病的预后。目前已有多种小分子在细胞水平展现出抑制NLRP3炎性小体过度激活的作用，部分抑制剂在相应疾病的动物模型中获得了预期的预防或治疗效果[5]。在生殖领域，已证明miR-520c-3p[41]、miR-223[42]、miR-9[43]可以抑制NLRP3炎性小体激活。一项初步研究证明，NLRP3炎性小体抑制剂MCC950在人类临床使用显示安全，而且足月时实施抑制并未阻碍分娩的生理过程，说明NLRP3炎性小体有望成为预防和治疗早产的靶点[44]。抑制剂格列本脲(glibenclamide)也可降低人类滋养细胞中炎性小体的激活，突出了靶向NLRP3炎性小体治疗胎盘疾病的潜力[45]。另一种抑制剂β-羟丁酸可以降低NLRP3炎性小体介导的疾病小鼠模型中Caspase-1的激活和IL-1β的分泌。而且，白藜芦醇[46]和桑葚[47]提取物可调节NLRP3炎性小体激活引起的炎症反应。未来，仍需高质量的研究进一步评估NLRP3炎性小体抑制剂在妊娠相关疾病防治中的有效性和安全性。

在人类妊娠过程中，NLRP3炎性小体作为炎症反应的核心环节参与先天免疫调节，一旦异常激活，所释放的过量促炎因子易破坏机体和组织促炎与抗炎蛋白的生理平衡，通过过度炎性反应和细胞异常死亡，导致早产、复发性流产和子痫前期等妊娠并发症。未来需要更深入的研究，探讨NLRP3炎性小体活性失调影响妊娠并发症的机制，包括精准调控NLRP3炎性小体活化的方法，找到更加安全、有针对性的治疗策略。