中草药脱毒技术研究进展

蔡时可，李静宇，梅 瑜，顾 艳，徐世强，孙铭阳，王继华

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传改良重点实验室/广东省道地南药资源保护与利用工程中心，广东 广州 510640）

中医药极具中国民族特色，发展和推进中医药产业现代化是国家中长期发展规划目标,其中,中草药是产业的基础也是我国重要的战略资源之一［1］。近年来，随着中医药事业的发展，对中药材种植业要求也越来越高，而种业是中药材生产的源头［2］。然而，在中药材种植生产实践中，由于植物病毒和病原菌等在中药材体内进行传递及积累，导致其正常生长受到抑制、甚至死亡，也是种性退化的主要原因，进而制约种植效益的提升［3］。特别是多年生无性繁殖的中草药品种，由于生长周期较长，受到病害侵染的机率高，生产上种源缺乏严格检测容易带毒，导致其农艺性状和药效成分下降，影响药农的种植收益和中医药产业的可持续发展。

自然界中，植物花叶病是较为常见的植物病害。该病毒可导致植物叶片萎蔫，呈黄白色斑驳，破坏叶绿体的完整性，光合作用速率降低，影响植物正常生长，甚至导致植株死亡。为解决这个问题，生产上可以利用植物脱毒技术开展健康种苗生产，对植物病毒和病菌进行有效清除。其中，以花叶病为代表的植物病毒是植物种苗脱毒的主要目标之一。病毒或病菌在茎尖等生长迅速的组织内由于繁殖速度低于植物细胞生长而含量低。利用植物激素处理离体的茎尖可获得完整的无毒植株。1952 年Morel 利用茎尖脱毒技术在感染花叶病毒的大丽菊得到无病毒植株，建立了植物组织培养脱毒技术，并在生产上得到逐渐应用［4］。目前，依托植物组培技术的脱毒方式是主要途径，生产上可结合物理和化学处理，更为有效清除植株体内的病毒和病菌，达到提纯复壮、恢复种性、有效提高产量和品质的效果。

近年来，植物脱毒技术已在甘蔗、草莓、马铃薯、甘薯和香蕉等植物上得到广泛研究及应用，有效推动种苗的标准化生产。目前在部分药用植物如半夏、菊花、地黄和百合等逐渐开展应用。植物脱毒技术可以恢复药用植物的种性，纯化种质，缓解当前中草药种植过程中种苗混杂的现状，与系统选育、工厂化育苗技术相结合，可有效提升中草药的育种水平，加速良种的应用，推进中草药种植的标准化生产，促进中医药产业的持续发展。

1 中草药脱毒方法

1.1 组织培养脱毒法

1.1.1 茎尖与珠芽培养脱毒法 自从Morel 获得脱毒大丽菊以来，植物健康种苗得到广泛研究与应用［3］。其原理是利用病毒在寄主植物体内不同组织和部位分布不均匀。其中，在分裂和组织生长迅速的茎尖生长点，同时也缺乏维管束系统的运输，病毒在胞间连丝传递的速率比较缓慢，病毒浓度积累低。因此，在靠近顶端分生组织，病毒浓度低，通过对茎尖剥离和培养，容易脱去病毒、细菌、真菌等，获得无病毒植株［3，5］。但茎尖大小与茎尖脱毒成活率和脱毒效果密切相关，是影响植物脱毒效率的重要因素。大体积的离体茎尖外植体容易成活，但是含有病毒的风险大，太小，则不容成活［6］。茎尖培养具有脱毒效果好、变异率低的优点，缺点是取材部位有限和操作繁琐。茎尖脱毒技术近年来在中草药上应用已取得一定的进展。

半夏茎尖在植物激素处理下容易形成愈伤组织，脱毒研究也相对较多，已获得多种脱毒健康半夏种苗。王宝霞等［5］利用浓度分别为1.5、2.0 mg/L 的6-BA 和2,4-D 处理半夏茎尖，愈伤组织诱导率最高，并可一次性成苗，检测结果表明TMV、CMV 和SMV 脱毒率均达到100%。李会等研究表明，掌叶半夏0.2～0.5 mm 的茎尖培养在MS 基础培养上添加1.0 mg/L 6-BA 和0.1 mg/L NAA 的培养基上，试管苗可以一次性诱导成功，成活率为53.3%，病毒脱除率为76.7%，而在培养基中附加247 mg/L NH4+可有效提高茎尖成活率至86.7%，移栽后成活率高达100%。MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+GA30.5mg/L 组合最有利于试管茎的形成和发育［6］。太子参的脱毒技术也较为成熟，一般取长约0.5 mm、带有1～2个叶原基的茎尖，以MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 为出苗最优培养基，培养40 d 出苗率可达到86.7%；而在1/2MS+1.5 mg/L IBA+0.5 mg/L IAA的培养基上，生根率达到93.3%；组培苗成活率为85.2%，定植成活率为100%，经过目测法和指示植物鉴定法检测，获得不带病毒组培苗，单株产量比传统种根组培苗增产102.7%［7］。大量研究表明，离体茎尖的大小为0.2 mm 左右，在太子参脱毒率和成活率方面可以达到最优［8］。

1.1.2 愈伤组织诱导脱毒法 单个茎尖通过器官发生途径进行增殖，扩繁效率相对较低，而植物愈伤组织途径的增殖更为有效。利用外源植物激素诱导植物器官或组织产生愈伤组织来诱导脱毒，再分化出芽并培养成为完整植株，经病毒检测筛选获得无毒植株的方法，在生产中往往选择病害较少的植物组织作为外植体，如茎尖、花药和嫩叶等来提高脱毒效率。愈伤组织诱导脱毒技术现已在多种大田植物上获得成功［3］。李松等利用甘蔗茎尖胚状体脱毒苗快繁技术，在茎尖胚状体分化苗增殖5 代后扩繁 2 589 倍，对甘蔗宿根矮化病病菌的去除率为95%，而花叶病病毒的去除率达到100%［9］。目前，利用愈伤组织开展脱毒中草药种苗繁育的还不多。其中，利用2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA 的激素可诱导丹参叶片产生愈伤组织，最佳分化培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，出芽率为90%；1/2 MS+0.5 mg/L IBA 适宜于试管苗生根，为解决丹参栽培中的资源和质量问题提供技术支撑［10］。但是，大中草药愈伤组织的再生体系是研究的热点，锁阳［11］、栀子［12］、川贝母等［13］等均有完整的再生体系，本研究室近年来也已获得了广藿香、穿心莲、春砂仁和千里香的再生体系，为脱毒种苗的规模化生产提供了技术支撑。

1.2 物理脱毒法

高温和低温处理可以钝化植物病毒的活性，而化学试剂可以抑制病毒的复制，物理和化学处理法可用于植物脱毒研究，而这些方法可与组织培养的方法结合，大大提升脱毒的效率［3］。

1.2.1 热处理脱毒法 和植物细胞相比，病毒的耐热能力相对较弱，在高温胁迫下容易失去活性，同时，适当的热处理也会加快植物的生长。因此，针对植物及病毒对温度的敏感程度不同的特点，进行特定的温度和时间范围处理，使植物病毒死亡或者钝化，或者降低病毒扩散速度，使其低于植物细胞分裂速度，容易在生长点形成无病毒区域；再利用细胞全能性，将把不含病毒的生长点进行人工培养，可以获得无毒植株［3］。近年来结合热处理和茎尖培养法比一些单独使用茎尖或热处理果树脱毒效果好。热处理一般采用35～55 ℃的热水或高温蒸汽、高温空气，处理时间根据温度的高低和外植体的种类决定［3］。例如，38.5 ℃热处理罗汉果组培苗10 d，可获得完全脱毒的健康种苗［14］；半夏茎尖呈叠套型生长，切取完整离体茎尖比较困难，采取高温钝化病毒结合茎尖脱毒的方法，将半夏的试管植株先采用高温（38 ℃，40 d）处理，然后再切取茎尖，去除病毒效果明显，脱毒率达到88.9%，是一种行之有效的方法和手段［15］。由于外植体成活率随热处理时间增加而降低，研究发现变温处理结合茎尖培养可有效提高外植体成活率和脱毒率。配合抗生素可进一步加强抑制高温条件下病毒的活性，极大地增加获得脱病毒植株的成功率，采取高温结合剥离茎尖脱毒的方法，再辅以抗生素的使用，可使病毒去除成功率高达85%以上［16］。

1.2.2 超低温处理脱毒法 超低温处理脱毒也是一种常用的植物脱毒方法，大多与植物组织培养技术配合使用，也是利用植物细胞的特定和病毒分布特点。植物茎尖和根尖的顶端分生组织的细胞具有排列紧密、体积小、无成熟液泡、细胞分裂和再生能力强的特点，由于细胞自由水含量低，细胞质容易处于无定形状态，在超低温环境中也较易存活，存在病毒的可能性也较小。而生长点周围的细胞大多为成熟的细胞，容易带有病毒，由于液泡成熟而含有大量自由水，在超低温环境中会形成树枝状冰晶，破坏细胞的膜结构，导致细胞死亡［3，17］。利用超低温对植物细胞进行选择性杀伤，杀伤含有病毒的成熟细胞，得到病毒含量低的顶端分生组织，容易得到脱毒植株［3，17］。超低温脱毒方法最早由Brison 使用，结合茎尖培养脱毒方法，成功去除了李属根状茎上的李痘病毒，脱毒率达到50%，是单一使用茎尖剥离脱毒率 19%的2.5 倍［18］。目前常用的超低温方法还发展出包埋干燥法、玻璃化法、小滴玻璃化法和包埋玻璃化法。低温脱毒的流程包括：一是预处理，超低温处理前，首先要对茎尖进行脱水和干燥，增强茎尖对超低温的耐受能力（可使用高浓度蔗糖的使其脱水，或者利用甘露糖、甘露醇和二甲基亚砜等保护剂，也可利用无菌风干燥或玻璃化处理）；二是液氮超低温处理（将茎尖置于液氮中），进行选择性杀死生长点外围细胞；三是冷冻处理的茎尖复苏及再生；四是再生植株的继代繁殖及相关检测，得到无毒的健康植株。其中，低温处理材料的状态是脱毒成败的关键因素，如外植体的大小、品种间的差异、外植体的生理状况。因此，超低温处理需要针对不同植物材料对脱水剂种类、脱水剂浓度、脱水时间、脱水步骤进行优化［17］。以太子参茎尖为外植体，采用超低温去除病毒方法，优化了芽增殖诱导、丛生芽诱导、生根壮苗的适合条件，获得了太子参规模化育苗技术。结果表明：超低温处理1 h 后，太子参脱毒率可达90%以上；规模化组培育苗最适宜配方为初代培养基为改良MS+2.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA，继代增殖培养基为改良MS+1.2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA，壮苗生根培养基为改良MS+0.2 mg/L KT+1.5 mg/L AD-6+10%蛋白粉［19］。

超低温处理、热处理及茎尖培养技术结合的综合脱毒方法也逐渐应用。靳慧洁等结合超低温脱毒、茎尖培养及热处理脱毒方法成功获得了百合脱毒苗［20］。然而超低温脱毒目前只应用于十几种植物，但广泛应用于植物材料的超低温保存，已成功应用于约200 种植物，其应用前景非常广阔［3，17］。超低温脱毒处理条件比较严格，是限制该方法应用的主要因素。因此，筛选出相对通用的超低温处理方法将是未来研究的重点［17］。

1.3 化学物质脱毒法

病毒抑制剂可通过不同的作用方式抑制和清除植物病毒，可用于中草药的健康种苗生产。目前常用于组织培养的病毒抑制剂有三氮唑核苷（病毒唑）、9-（2-羟二氧）甲基鸟嘌呤、2-硫尿嘧啶、叠氮胸苷、5—二氢尿嘧啶（DHT）和双乙酰-二氢-5=氮尿嘧啶（DA—DHT）等［3］。目前的研究表明，病毒唑的抑制效果相对较好，应用也较为广泛。这些药物可以直接注射到带病毒的植株上或者添加到植株生长的培养基上用于植物病毒的清除［21］。采用茎尖培养和使用病毒抑制剂相结合的脱毒方法，对材料大小要求不严，则对于有些比较难脱除的病毒，采用病毒抑制剂结合热处理和茎尖培养的方法使用，效果较好，如10 mg/L 病毒唑和热处理（39 ℃处理15 d），对于东方百合的无症病毒及百合斑驳病毒的脱毒率分别为55%和40%［22-23］。

在生产上中草药的脱毒技术也逐步从茎尖培养、热处理脱毒、冷冻脱毒、病毒抑制剂处理等单一脱毒方法，向2 种和3 种复合方法结合使用发展，逐步提高脱毒率；同时，培养条件的不断优化也逐步提高成苗率和繁殖率，提高工厂化和商品化规模，降低生产成本，促进脱毒苗的生产应用［5，24］。

1.4 病毒检测技术

利用病毒学检测方法来确定植物脱毒效果，在健康种苗的生产上，植物病毒检测方法与有效的脱毒方法都非常重要。自1990 年起，建立了大豆黄叶病毒、马铃薯卷叶病毒、马铃薯A 病毒、甘蔗花叶病等多种植物病毒的检测方法。病毒检测的方法也随着科学技术的发展不断改进，包括目测法、指示植物法、显微镜检测、核酸检测和免疫检测等，这些方法在脱毒苗的检测中各有优劣。目测法是传统上一直沿用的检测方法，操作简单，但是这种方法依赖植株的病症，因此需要较长的时间，对一些未知的病毒很难检出。指示植物法，对检测的范围有所增加，结果更为准确，但也存在费时，效率低的问题。近年来随着生物科学的迅猛发展，许多先进的理化与分子检测技术如免疫学方法，分子生物学方法等成为病毒检测技术的常用的方法［21］。其中，依赖以核酸的病毒检测技术主要有简并引物PCR 技术、免疫捕捉PCR 技术、多重PCR 技术、环状等温扩增技术和荧光定量PCR 方法等5 种。与其他方法相比，荧光定量PCR 方法的特异性强，灵敏度高适合高通量的检测，因而适于广泛应用［21］。

在脱毒中草药的检测方面也是经历了从直观到微观的过程。早期，采用田间观察法和指示作物法检测亳菊病毒病，其中，黄瓜、中国枸杞、千日红等为指示植物，但大多数病毒病症状为花叶、黄化、畸形，易与环境胁迫或生理病害混淆，因此田间观察法具有一定的缺陷［25］。利用SMV、CMV、TMV 单克隆抗体和RT-PCR 方法对半夏无毒苗进行病毒检测，表明不同培养基对病毒的脱毒效果有影响。其中培养基H 对SMV、CMV 和TMV 的脱毒率达到100.0%;而培养基B所诱导的无毒苗脱毒不彻底［5］。太子参中的的主要病毒为芜菁花叶病毒（TuMV）和蚕豆萎蔫病毒（BBWV）根据 GenBank 数据库中的 TuMV、BBWV 外壳蛋白（CP）基因核苷酸序列的保守区域分别设计简并引物建立的双重 RT-PCR 快速检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测TuMV 和BBWV［26］。目前中草药脱毒苗的应用还不多，检测的重视程度还有待提高。

2 中草药种传病源

2.1 中草药种传病源

中草药的病源主要有病毒、细菌和真菌，其中在百合、半夏、地黄和菊花中植物病毒的危害较为常见，如半夏病毒病、菊花病毒病、地黄病毒病等病毒病，而细菌病有广藿香青枯病、广藿香根瘤病等。生产上，百合由于长期采用鳞茎、鳞片等营养器官进行无性繁殖，加之，生产周期长，导致病毒积累，种球种性退化严重，直接影响百合的品质和产量，制约了产业的发展，在贵州铜仁、毕节等产地尤为突出［27］。目前报道的菊花病毒有10 余种，但不同的品种和种植区域病毒的种类也有差异［25］。其中，在浙江省桐乡侵染杭白菊的病毒病原为菊花病毒［28］。半夏的病毒种类较多，且与种植地区和品种相关，病毒种类主要有紫花苜蓿花叶病毒、马铃薯病毒、大豆花叶病毒、烟草花叶病毒、番茄斑萎病毒、黄瓜花叶病毒、南芥菜花叶病毒、弹状病毒和魔芋花叶病毒等均有报道［5，15-16］，其中在来自浙江宁波、浙江萧山、河北、安徽、四川南充、北京和江苏丰县七个地区的三叶半夏中均存在黄瓜花叶病毒或大豆花叶病毒，但野生三叶半夏的带毒率明显低于栽培三叶半夏［29］；同时，在三叶半夏中还有检测到软腐病原菌［29］。太子参的病毒病同样普遍，在福建省闽东地区侵染病毒种类有4 种：芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒和烟草花叶病毒［7］。烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒和康乃馨意大利环斑病毒等在怀地黄上均有报道［30-31］。河北传统药材产区的丹参易感染黄瓜花叶病毒［32］。藏红花的主要病毒有芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒、鸢尾花叶病毒、烟草脆裂病毒和菜豆黄花叶病毒［3］。

2.2 种传病源危害现状

植物病毒在入侵宿主后，在宿主细胞内进行自我复制和传播，干扰新陈代谢，最后使整株植物发病，甚至导致植物死亡，植物病毒素有“植物癌症”之称，自然界中可侵染植物的病毒有600 余种，但缺乏病毒病的特效治疗药物，每年造成的经济损失约600 亿美元以上［5，8］，已成作物产量和质量降低的主要因素之一［33-34］。随着中草药的规模化人工种植，植物病毒的危害也日益严重。

病毒侵染人工栽培的半夏后，叶片皱缩呈斑驳、花叶、变小、沿脉变色，植株矮化及畸形等症状［5，15-16］。在罗汉果主产区90%以上的植株感染花叶病毒，给种植户造成了巨大的经济损失［35］。菊花被病毒侵染后，影响植株生长，导致植株矮小，花的直径变小，叶片上出现斑点甚至坏死，在减产的同时还严重降低经济价值［25］。长期来，太子参以种根无性繁殖，在产区往往因为连作和蚜虫传毒，根内的花叶病毒逐年积累，造成叶片光合作用变弱，太子参病毒病普遍发生，参根产量和质量下降严重［7，36］。目前，太子参花叶病病情日趋严重，部分地区发病率高达60%～90%,每年平均减产22%［7］。太子参怀地黄病毒导致叶片呈现花叶、褪绿、黄化及畸形等典型病毒病症状；地下块根表现为不能正常膨大、笼头变长和产量严重下降［30-31］。河北产区的丹参易感染黄瓜花叶病毒，产量及丹参酮含量大幅下降［32］。靠分球无性繁殖的藏红花，积累病毒后使品质及产量下降［3］。对脱毒植株进行规模化生产和应用是防治植物病毒病最有效的途径之一［19］。目前，植物病毒的剔除是利用植物脱毒技术开展中草药健康种苗生产的热点。但与大田农作物相比，中草药的病害研究目前还相对落后。

3 脱毒技术在中草药上的应用

3.1 脱毒种苗的表现

植物病毒主要是通过植物营养体的无性繁殖进行传播，并逐渐积累，长期依赖无性繁殖的品种，由于体内病毒大量积累，致使植物发生病症，并导致种性退化，无法满足中药材生产可持续发展［24］。脱毒苗在种植早期不存在病毒的侵扰，在生长、抗性上要优于传统种苗，因此在产量、品质上有很大的提升。目前对于一些中草药病毒病害的防治还没有特别安全有效的方法,而半夏脱毒苗的培养成为解决中草药病毒病最经济、有效、安全的途径［5］。

3.1.1 对生长的影响 脱毒苗最直观的表现在于其形态的变化，生长速度加快，生长势明显提高。脱毒半夏植株叶色绿、生长健壮、整齐、抗病效果明显，较未脱毒植株株高增加 0.7～1.7 cm，珠芽离地面高度增加0.2～0.3 cm［15］。麦冬脱毒苗分蘖快，分蘖数明显增多，块根数目增加［37］。脱毒怀地黄苗的株高、冠幅、叶片数、最大叶面积、功能叶片的光合色素含量、净光合速率、蒸腾速率等各项指标均优于非脱毒苗、块根膨大速度也明显加快［38-39］。太子参的3 种组培脱毒种苗（即茎尖苗、愈伤组织苗、种子苗）的大田生长速度均显著优于对照苗［36］。但是随着种植代数的增加，植株在生长过程中受到病毒的危害，生长的优势逐渐减少，需要重新脱毒。脱毒怀地黄一代、二代、三代、四代种苗的大田生长叶片进行了病毒检测，一代和二代没有感染病毒，从第三代开始感染病毒，第三代的感染率为60%，第四代的感染率为100%［40］。

3.1.2 对产量的影响 脱病毒后的药用植物产量明显提高。杭白菊脱毒种苗在分枝数、有效花朵数、叶绿素相对含量参数方面与常规苗有显著性差异，脱毒早小洋菊单产达490.1 kg/667m2，脱毒小洋菊单产达1 083.3 kg/667m2，分别增产11%和29%［28］。祁菊花脱毒后，菊花的花朵数增加，花的干物质产量显著提高，增产幅度为37%～50%［41］。脱毒微型半夏种茎播种后产生的C2 代与野生种茎相比具有显著的生长优势，产量达1 148.48 kg/667m2，增殖系数为5.74，产量是野生种的2.02 倍，与野生种茎相比产量具有显著差异［42］。薄荷新品种阜油1 号脱病毒苗鲜草量增加3 654.15～7 564.35 kg/hm2；出油率提高0.3%～2.3%，在界首市、太和县示范基地大田种植增产达30%［43］。盆栽麦冬脱毒苗结果发现，单株产量脱毒苗与未脱毒苗分别为4.87、3.36 g，产量增加44.9%［37］。太子参的3 种组培脱毒种苗参根产量均显著优于对照［36］。

随着脱毒种苗在田间的种植，种苗的世代增加，病毒也会不断在体内积累，导致产量逐渐下降。脱毒怀地黄苗的块根产量提高、品质改善，增产幅度在77.35%以上［38］。脱毒怀地黄不同世代脱毒种苗在大田生长中不断感染病毒，脱毒一代、二代、三代、四代种苗单产、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，其中单产分别为 5 603.90、4 359.50、3 992.50、3 258.20 kg/hm2［40］。

有些无性繁殖的品种，第一代脱毒种苗由于母体往往偏小，在第二代得到恢复，产量会增加。脱毒玄参子代高产试验中脱毒玄参产量比未脱毒玄参产量平均增产30%。三代、二代、一代种苗均较未脱毒种苗有显著差异。并且三代种苗产量高于二代，二代高于一代，这可能是脱毒玄参在栽培中复壮引起［44］。从生长发育（农艺性状、生理生化特性）、产量和品质方面，对怀黄菊一代、二代、三代脱毒苗进行比较研究，二代种苗产量最高、品质较佳，为最佳种植代数。怀菊花脱毒苗规模化生产采用二级繁育技术体系［45］。因此，脱毒中草药种苗在使用过程中既要注意病毒的检测，确保使用无毒苗，同时也要比较不同世代的产量，发挥其增产的优势。

3.1.3 对药效分成含量的影响 中药材有效成分的含量高低和稳定性是其治疗效果的基础，也是中草药种植的最基本的要求。脱毒种苗的后代生长旺盛、整齐一致，在增产的同时，其稳定性增加，有效成分也增加。半夏块茎鲜汁中分离的半夏蛋白是半夏抗肿瘤和抗生育等药理作用的有效成分，脱毒半夏块茎中蛋白平均含量为2.86%，比常规的半夏块茎中蛋白含量高0.3%［46］。脱毒‘早小洋菊’和‘小洋菊’中总黄酮和绿原酸含量高于常规苗，绿原酸含量高于药典的规定［28］。脱毒怀地黄苗的块根产量提高，品质改善，增产幅度在77.35%以上，药用成分梓醇含量提高了32.90%［38］。3 种太子参组培脱毒苗的参根氨基酸总量都明显分别高于对照苗［36］。

3.2 脱毒种苗的现状

3.2.1 健康种苗生产现状 标准的脱毒种苗生产流程，是中草药种苗脱毒质量稳定的基础。相比果树和花卉以及大宗农作物，中草药品种的特异性、当前中草药育种水平和种植规模限制了其应用。组培技术是脱毒的一个关键环节，在保障种苗质量的基础上，对组培过程中培养参数的改良，相应地降低了生产成本，可使中草药种苗脱毒技术更为广泛地推广应用，可以有效促进中草药的生产。改良地黄组培及快繁培养基配方，可降低试管苗生产成本47%左右，缩短继代时间以及组培和常规营养繁殖相结合，提高了快繁的速度和系数［47］。在目前育种水平低下的情况下，利用脱毒技术与组培工厂化育苗可以迅速开展良种的选育和扩繁。

中草药种苗脱毒育苗流程：选取种性优良的健壮单株→确定所需脱毒病原菌的种类→优化病原物清除方法→选择综合方法进行病原物的去除→根据脱毒品种建立相应组织培养体系→丛生芽的诱导与增殖→外植体材料病原早期检测→健康种苗增殖扩繁→一级苗圃假植与扩繁→大田一级种苗田扩繁→病原检测→合格种苗→大田二级种苗田扩繁或在生产上推广应用［48］。部分中草药品种存在二代苗的产量高于原种，在生产上根据种苗生长的特点选择合适的世代苗作为种苗。其中，怀黄菊二代脱毒苗产量在三个世代中最高、品质较佳，为最佳种植代数，在怀菊花脱毒苗规模化生产采用二级繁育技术体系［45］。脱毒苗的生产中要做好病虫害防控，严格开展病毒的检测，确保生产用种的质量。

3.2.2 脱毒种苗的产业发展现状 生产上使用的脱毒种苗作为生产用种的较为成熟，但是在中草药上还不多，仅有菊花、半夏、地黄、罗汉果和太子参等进行了生产试验。其中，健康种苗的成本是目前影响其规模化应用的主要限制因素。高效的种苗生产体系对降低种苗生产成本至关重要，体系主要包括种植的基质、肥料和密度等。在基质方面，黄壤土使用方便，生产成本低，选用含水量在20%～30%的疏松黄壤土作为半夏组培苗的基质易获得高产，并且，基质保持水分能力越强，产量越高，基质保持水分能力越弱，产量越低［42］。同时，种苗的种植密度是影响中药材产量最重要的因素，半夏组培苗种植密度大时，多小块茎，少大块茎；密度小时则相反。因此，在半夏微型块茎繁殖生产时，需要增加移栽密度从而提高其繁殖的系数。在生产上脱毒种茎的适宜移栽密度为200 株/m2，其C2代产量可达1 148.48 kg/667m2，种苗增殖系数为5.74，产量是野生种的2.02 倍，具有显著的生长优势［42］。怀地黄脱毒苗在生产上，其冠幅、叶片数和叶片面积随着种植密度增加而减少。生产上其种植密度宜为20 000 株/667m2，其株高、产量和药用成分梓醇的含量最高，鲜质量为6 105.80 kg，干质量为1 393.30 kg，梓醇含量2.86%［49］。脱毒怀地黄苗块根产量提高、品质改善，增产幅度在77.35%以上，药用成分梓醇含量提高32.90%［38］。

脱毒种苗的生长与营养条件密切相关。在氮磷钾复合肥1 687.5 kg/hm2，较适宜脱毒怀地黄苗的生长发育，怀地黄苗的功能叶面积（8 月份）和冠幅（9 月份）最大，叶绿素总含量、净光合速率和蒸腾速率也最高［50］。生产上脱毒种苗的产量根据中草药品种的特性而增产的方式不同。其中，生育期延长、植株生长快、健壮、分叉多、花数多和单花干重高等是脱毒菊花苗增产的主要因素［41］。而杭白菊、祁菊花脱毒种苗在分枝数、有效花朵数、叶绿素相对含量、花的干物质产量显著性高于常规种，增产10%～50%［28，41］。麦冬脱毒苗盆栽结果发现，其分蘖速度快，分蘖数增多明显，有效块根数增加，单株产量脱毒苗与未脱毒苗分别为4.87、3.36 g，产量增加44.9%［37］。通过茎尖和愈伤组织脱毒的太子参种苗，在种植过程中生长速度和参根产量根氨基酸总量显著优于对照苗［36］。脱毒苗在生产上作为种苗，其存在后期重新感染病毒的风险，因此在脱毒苗的种植过程中脱毒苗的代数需要科学控制。其中，脱毒怀地黄种苗在大田种植过程中，前两代没有病毒感染，而从第三代开始感染病毒，感染率达到60%，第四代则完全感染；并且随着病毒感染率的上升，产量、梓醇和毛蕊花糖苷含量均依次下降，脱毒的优势丧失［40］。

4 展望

目前，很多中草药品种都是通过无性繁殖方法进行种苗培育，如丹参、半夏、菊花、地黄、春砂仁、罗汉果、紫菀、白芷和太子参等，由于多年的自繁自育，种苗培育缺乏科学指导和统一标准，大多数品种在种植过程中都已经感染病毒或病菌。病毒和病菌往往和种苗伴生，加之，生产上缺乏高效的防治方法，带毒种苗导致中草药种植过程中管理困难和成本增加等危害，严重制约中草药的标准化种植和种植效益的提升。健康种苗是提高这类中草药生产效益最为有效的方法之一。植物目前商业化的脱毒试管苗在果树、蔬菜、花卉及药用植物上的应用已经非常广泛，并取得了良好的效益，如香蕉、木瓜、马铃薯、甘薯、草莓和金线莲等。在中草药的脱毒技术上可使用的传统方法较多，但效率相对较低，而且个别病毒不能完全清除［37］。一般生产上基于茎尖组织培养的脱毒效果最为彻底，也得到越来越多的研究与应用。随着技术的发展，综合脱毒方法在健康种苗上的应用逐渐增加。其中，组织培养结合热处理或病毒抑制剂处理将是健康种苗培育的有效途径［3］。其中，组织培养技术要求较高，受到的限制因子较多，其中植物的遗传特性、外植体的生理状态和所清除病毒或病菌的种类是影响脱毒效率的主要因素。培养过程中，培养基的组分、温度和光照都直接影响组培苗的生长和发育［38］。培养基组分也与脱毒的效率相关，含有高浓度6-BA 的培养基可加快半夏茎尖细胞的分裂速度，抑制了病毒向茎尖部位的移动或积累而脱毒更加彻底［5］。因此，不断改进植物组培脱毒技术以适应大规模的工厂化和商品化势在必行。随着中医药事业对中药材需求的日益增加，推广健康种苗是有利于中草药种植的绿色种植和可持续发展。因此，应加大中药脱毒苗研制技术的投入，建立脱毒方法，提高脱毒和繁殖效率，降低生产应用成本，提高种植者的效益。同时，加大中草药健康种苗的大面积产业化应用和推广，促进中草药种业的升级和中药农业的高质量发展［37］。