石墨烯对碳纤维增强聚醚醚酮生物活性的影响

刘洁

摘 要：为促进碳纤维增强聚醚醚酮（CFR-PEEK）的生物活性，提高其临床应用效果，使用石墨烯对CFR-PEEK进行表面修饰。制备石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮，对其稳定性和亲水性进行分析;将其应用到白鼠骨髓基质干细胞中分析其对增值和骨分化的影响。实验结果表明，制备的石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮具有比较好的稳定性;相比于CFR-PEEK，石墨烯表面修饰CFR-PEEK具有更好的亲水性;石墨烯表面修饰CFR-PEEK材料能够促进白鼠骨髓基质干细胞增值，能够促进白鼠骨髓基质干细胞的成骨分化。所以石墨烯表面修饰能够显著促进CFR-PEEK材料的生物化。

关键词：石墨烯;表面修饰;碳纤维增强聚醚醚酮

中图分类号：X703 文献标识码：A     文章编号：1001-5922（2021）11-0049-04

Effect of Graphene on Bioactivity of Polyetheretherketone Reinforced by Carbon Fiber

Liu Jie

（Xi an Medical University， Xi an 710021， China）

Abstract：In order to enhance the bioactivity of carbon fiber （CFR-PEEK） and improve its clinical application effect， graphene is used for surface modifying CFR-PEEK. Preparing graphene surface modified carbon fiber enhanced polyether， analyzing its stability and hydrophilic properties， applied to white rat bone marrow MSCs to analyze its effect on value appreciation and bone differentiation. Experimental results show that the prepared graphene surface modified carbon fiber enhanced polyether ether one has good stability. Comparing to CFR-PEEK， graphene surface modified CFR-PEEK is better hydrophilic than it. Graphene surface modified CFR-PEEK material promotes the appreciation of white rat bone marrow MSCs and the osteogenic differentiation of white rat BMSCs. Therefore， graphene surface modification can significantly promote the biochemistry of CFR-PEEK materials.

Key words：graphene; surface modification; carbon fiber-enhanced polyether ether ketone

0 引言

聚醚醚酮和碳纖维结合之后能够弥补聚醚醚酮软化温度较低和弹性模量较小的缺陷，因为碳纤维具有很高的强度，并且其模量高，结合之后的材料为碳纤维增强聚醚醚酮。这种材料具有很好的生物相容性，而且弹性模量和人体骨组织相似，将其应用到骨科治疗手术中，能够有效解决骨溶解、骨吸收等问题[1-2]。

聚醚醚酮在骨科领域中的使用范围越来越广，但在使用聚醚醚酮的过程中发现该材料具有生物惰性，导致与周围骨组织的骨整合存在缺陷[3]。为了解决这个问题，很多学者进行了大量研究，当前提高聚醚醚酮生物活性的方法有两种，分别为表面修饰和聚醚醚酮复合材料，其中表面修饰就是对材料进行表面修饰或者表面涂层，从而提高材料的生物活性[4]。通过使用化学或者物理的方式对聚醚醚酮进行修饰，其中物理处理就是使用电磁波激发产生活性粒子，然后作用于生物材料表面，这种方式不会改变材料的力学性能等其他特性，只会改变生物材料的理化性质，常用的物理处理方式有加速中性原子束、等离子体修饰等。化学处理方法不仅会改变材料的理化性质还会改变材料的力学性能等其他特性，常用的化学处理方式比较少，主要为磺化处理和湿化学修饰。本文将采用表面修饰的方式提高聚醚醚酮生物活性。

石墨烯具有比表面积大、强度高、弹性模量大、稳定性好、热传导系数高、生物相容性好等特点，而且属于已知的最薄材料[5]。石墨烯作为一种新型纳米材料，有学者将其应用到骨领域中，发现该材料能够促进骨分化，并且具有骨再生的能力[6-7]。随着石墨烯材料的广泛应用，使用传统的制备方式不能满足需求，于是后来发现使用化学气相沉积法能够制备更加优异的石墨烯，并且制备面积大，能够满足当前需求[8]。石墨烯作为一种理想材料，石墨烯表面修饰能够显著提高材料的生物活性，能够促进细胞黏附、成骨分化和增殖;而碳纤维增强聚醚醚酮的生物惰性和疏水性限制了其发展，将石墨烯应用到碳纤维增强聚醚醚酮中能够解决其存在缺陷，使其在骨科治疗中具有更好的临床效果。本文将通过实验研究的方式，使用石墨烯表面修饰提高碳纤维增强聚醚醚酮生物化性能。

1 材料和方法

1.1 实验材料和设备

实验需要的主要材料：医学植入级别的碳纤维增强聚醚醚酮、石墨烯（化学气相沉积法制得）、丙酮、聚甲基丙烯酸甲酯（质量分数7%）、无水乙醇、CCK-8检测试剂盒、白鼠骨髓基质干细胞、培养基等。

实验需要的主要设备：拉曼光谱仪、电子扫描显微镜、烘干箱、离心机等。

1.2 试样制备

石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮的制备方式采用化学侵蚀物理吸附方法。其具体制备方式如下：

（1）裁剪出一定尺寸的石墨烯，然后使用聚甲基丙烯酸甲酯涂抹在石墨烯表面，再将其放入烘干机中15 min，达到规定时间之后取出冷却备用。由于固胶过程中石墨烯存在铜物质，需要使用氯化铁溶液将其取出，然后将得到的薄膜物质放到去离子水中反复清洗，目的在于洗掉氯化铁溶液，得到的薄膜物质作为接下来的备用材料。

（2）将上述备用材料使用物理吸附原理转移到碳纤维增强聚醚醚酮材料的表面，24 h之后将其放到烘干箱中5 h。

（3）取出材料放到丙酮溶液中直至其完全溶解，就得到了石墨烯表面修饰的碳纤维增强聚醚醚酮材料。然后还需要对其进行3次超声清洗，每次5 min，最后放入烘干机中烤干即可用做实验。

1.3 白鼠骨髓基质干细胞的培养

在无菌环境下首先收集到的白鼠骨髓基质干细胞为第0代细胞，然后将其放到细菌培养箱中进行培养，一整天之后将培养基吸出，并且将瓶壁上的细胞和杂质去除，然后再加入培养基。之后，需要每隔3 d换一次培养基，直至细胞生长超过培养基瓶底80%时。

实验中需要将第4代的细胞用做实验，于是需要对0代细胞进行传代培养。首先清洗干净瓶中的培养基，然后将贴壁生长的干细胞使用胰蛋白酶消化，在该消化过程中需要使用显微镜对其形态进行观察，如果细胞变为悬浮状态之后，需要将培养基放入其中从而终止消化。之后将瓶中的細胞悬液放到离心机中离心处理5 min，将液体中上清液去掉，保留剩余部分，然后再在该剩余液体中加入培养基，使用滴管反复吹打以重悬细胞，最后使用1∶3对细胞进行传代培养。细胞培养到第4代之后，取其中状态良好的白鼠骨髓基质干细胞作为体外细胞实验。

1.4 稳定性分析

首先将实验组和对照组中材料分别放到烧杯中，然后加入磷酸盐PBS溶液（磷酸盐缓冲液），将其放到超声清洗机中进行超声处理，清洗时间为60 min。之后使用扫描电子显微镜进行观察，看两种材料表面是否有明显变化。

1.5 亲水性测定

实验中需要检查材料的亲水性，于是使用接触角测量仪对材料进行检测。首先在材料表面选择3个不同区域，然后将3 ?m的水滴到材料表面，水滴滴落过程中与材料表面接触的瞬间使用照相机拍摄出来，然后使用机载软件计算接触角大小，最终利用该接触角的大小来反映材料的亲水性性能。

1.6 统计分析

使用SPSS软件进行数据分析，统计方法使用t检验，然后实验数据以“均值±标准差”进行表示，当“P<0.05”时表示具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮的稳定性

对材料进行超声振荡处理，然后使用扫描电子显微镜对处理之后的材料进行观察，结果如图1所示。从图1中可以看出，经过超声处理之后的材料和没有处理的材料并没有什么明显变化，也没有出现脱落或者破损情况。结果表明，石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮具有比较好的稳定性。

2.2 石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮的亲水性

通过使用静态水滴法对材料进行接触角测量，结果如图2所示。接触角越大，表明材料的亲水性越差;反之，亲水性越好。从图2中可看出，石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮材料的实验组接触角明显小于碳纤维增强聚醚醚酮材料的对照组，并且两组之间差异显著（P<0.05）。这说明碳纤维增强聚醚醚酮经过石墨烯表面修饰之后能够提高材料的亲水性。

2.3 材料对白鼠骨髓基质干细胞增殖的影响

选择生长状态良好的第4代白鼠骨髓基质干细胞作为实验对象，让其接种到实验组和对照组的材料上，然后将其放到细胞培养箱中培养1、3、5和7 d，再将相应的试样放到CCK-8检测试剂盒中，用吸光度的值来表明白鼠骨髓干细胞增殖情况，实验结果如图3所示。从图3中可以看出，在每个细胞培养时间上，石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮的吸光度明显高于对照组，并进行组间统计学分析，发现具有显著性差异（P<0.05）;当细胞培养时间不断增加时，实验组和对照组的吸光度都处于不断上升状态。可以看出石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮材料能够促进白鼠骨髓基质干细胞增殖。

2.4 材料对白鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

将白鼠骨髓基质干细胞接种到实验组和对照组的材料上，将两种材料成骨分别诱导7、14 d;然后再使用蛋白质印迹法（Western Blot）检测骨形态发生蛋白-2、Runt转录相关因子2、Ⅰ型胶原蛋白和Osterix蛋白的表达水平。为了便于观察，还需要使用Alpha软件对图形进行处理，然后得到不同的光密度值，结果如表1所示。

从表1中可以看出，当成骨诱导时间为7 d时，实验组的Runt转录相关因子2、Ⅰ型胶原蛋白和Osterix蛋白的表达水平明显高于对照组，并且每组之间差异显著（P<0.05）;而骨形态发生蛋白-2，实验组和对照组间相差不大，差异不显著（P>0.05）。当成骨诱导时间增加为14 d时，实验组的Runt转录相关因子2和Ⅰ型胶原蛋白明显高于对照组，并且两组间差异显著（P<0.05）;而实验组骨形态发生蛋白-2Osterix蛋白和对照组的蛋白条光密度值的差别比较小;另外，实验组的骨形态发生蛋白-2还低于对照组，但这两种蛋白实验组和对照组之间差异不显著（P>0.05）。还可以看出，成骨诱导14 d后实验组和对照组的骨形态发生蛋白-2和Osterix蛋白分别低于诱导时间为7 d的两组。由此，石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮能够促进白鼠骨髓基质干细胞的成骨分化。

3 讨论

随着我国老龄化的不断增长，骨关节疾病的发生概率越来越大。作为常用的骨科植入材料，聚合物、金属、复合材料和陶瓷等都会存在一定的缺陷，比如陶瓷的力学性能较差，金属会引起骨溶解等，所以使用一种新材料应用到骨科治疗中受到学者的广泛关注和重视。碳纤维增强聚醚醚酮弹性模量和人体骨组织相似，能够经受长时间的疲劳，已经作为骨科植入材料在临床中应用。临床结果表明碳纤维增强聚醚醚酮的应用是有效和安全的，并且其耐久性比其他基底材料好[9]。另外，碳纤维聚醚醚酮材料还处于不断研究之中，因为该材料的生物活性比较低，限制了该材料的应用发展。石墨烯在不断研究和应用过程中发现具有促进骨髓基质干细胞成骨分化的能力，本文通过石墨烯表面修饰的方式促进该材料的生物活性。首先制备了石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮材料，对该材料进行超声处理，得出该材料具有比较好的稳定性;然后分析材料的亲水性。有研究表明，亲水性的提高能够提高初始蛋白和生物材料之间的相互作用，有利于促进细胞分化和增殖[10]。由本实验可知，石墨烯表面修饰能够提高材料的亲水性。石墨烯的表面积、粗糙程度、形貌等都会影响细胞骨分化和增殖[11]。

骨髓基质干细胞是一种非常理想的组织工程种子细胞。本实验中使用白鼠骨髓基质干细胞作为实验对象，当细胞发展到第4代之后，细胞具有比较强的增殖能力，于是使用第4代细胞进行实验。为了研究石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮对干细胞增殖的影响，本实验进行了CCK-8检测，结果表明：该材料能够促进白鼠干细胞增殖，反映出该材料的生物活性和生物相容性变得更好。Western Blot检测结果可以看出成骨诱导一段时间之后，实验组的Runt转录相关因子2、Ι型胶原蛋白和Osterix蛋白的表达水平明显大于对照组;但是当成骨诱导时间为14 d时，实验组中骨形态发生蛋白-2的表达水平比对照组的低，出现这种现象，可能是石墨烯和骨形态发生蛋白-2有着相同的诱导成骨分化能力所致。

4 结语

由于碳纤维增强聚醚醚酮的生物惰性，本实验使用石墨烯表面修饰促进该材料的生物活性。通过化学侵蚀物理吸附方法制备石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮力学性能，这种方式不会对碳纤维增强聚醚醚酮材料的优异力学性能造成影响。对该材料进行表征分析，实验结果表明：该材料具有比较好的稳定性和亲水性。最后分析了该材料对白鼠骨髓基质干细胞的骨分化和增殖情况的影响，实验结果表明：石墨烯表面修饰碳纤维增强聚醚醚酮能够促进白鼠干细胞的增殖和骨分化，表面经过石墨烯表面修饰之后，碳纤维增强聚醚醚酮的生物活性增强。

参考文献

[1]敖玉辉，石 飞，尚 垒，等. 碳纤维增强聚醚醚酮复合材料的制备与性能[D]. 长春：长春工业大学，2014.

[2]林有希，高诚辉. 碳纤维增强聚醚醚酮复合材料的研究及应用[J]. 塑料工业，2005，33（10）：5-8，20.

[3]WANG H， MING X， WEI Z，et al.Mechanical and biological characteristics of diamond-like carbon coated poly aryl-ether-ether-ketone[J]. Biomaterials，2010，31（32）：8 181-8 187.

[4]耿 鹏. 聚醚醚酮及其复合材料增材制造机理与实验研究[D].长春：吉林大学，2019.

[5]WEI W，QU X. Extraordinary Physical Properties of Functionalized Graphene[J]. Small，2012，8（14）：2 138-2 151.

[6]LEE W C，LIM C，SHI H，et al. Origin of enhanced stem cell growth and differentiation on graphene and graphene oxide[J].Acs Nano，2011，5（9）：7 334-7 341.

[7]NAYAK T R，ANDERSEN H， MAKAM V S，et al. Graphenefor controlled and accelerated osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells[J]. Acs Nano，2011，5（6）：4 670-4 678.

[8]史永貴，王东，张进成，等. 化学气相沉积法生长石墨烯的研究[J]. 人工晶体学报，2014，43（7）：1 620-1 625.

[9]贾 慧. 氧化石墨烯修饰的磺化碳纤维增强聚醚醚酮复合材料的制备及体外成骨研究[D]. 太原：山西医科大学，2019.

[10]GITTENS R A，SCHEIDELER L，RUPP F，et al. A review on the wettability of dental implant surfaces II： Biological and clinical aspects[J]. Acta Biomaterialia，2014，10（7）：2 907-2 918.

[11]MING G，LIU Y， CHEN T，et al. Is graphene a promising nano-material for promoting surface modification of implants or scaffold materials in bone tissue engineering？[J].Tissue Engineering Part B-Reviews，2014，20（5）：477-491.