CYP2C9和VKORC1基因多态性对华法林个体化用药的指导价值

丁维剑，汪亚南，苗仁华

华法林是维生素K拮抗剂，也称香豆素类口服抗凝剂，主要用于静脉血栓栓塞性疾病的一级预防和二级预防。研究表明，华法林预防和治疗血栓栓塞性疾病的疗效确切且口服给药便利，是临床应用较广泛的一线口服抗凝剂［1］。但华法林治疗时间窗较窄，个体差异较大，需频繁检测国际标准化比值（international normalized ratio，INR）并实时调整用药剂量，以权衡治疗效果和出血风险，这也是导致华法林临床使用受限的原因之一［2］。华法林的治疗效果受到多种因素的影响，以遗传因素中基因多态性较为突出［3］。

细胞色素P450 2C亚家族是一类重要的药物代谢酶，华法林在肝脏中代谢主要依赖细胞色素P450。华法林是S-华法林和R-华法林的光学异构体混合物，其中S-华法林主要由CYP2C9代谢，可以提供华法林70%的抗凝活性［4-5］；同时VKORC1可通过干扰凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ的合成而影响华法林的抗凝作用［6］。因此，CYP2C9和VKORC1基因多态性与华法林的抗凝作用密切相关［7］。

近年随着药物基因组学的发展，有大样本量的全基因组关联研究（genome wide association study，GWAS）和临床研究表明，CYP2C9和VKORC1基因在华法林发挥抗凝作用中起主要作用［2，8-10］。华法林药物基因组学联合会（The International Warfarin Pharmaeogenetics Consortium，IWPC）研究显示，基于华法林药物基因组学（包括基因型）构建的药物基因组学的临床用药模型优于基于临床特征构建的临床用药模型［11］。目前，IWPC建立的华法林剂量公益网站（www.warfarindosing.org）［12］会根据患者的基因型和临床特征（如性别、种族、年龄、身高、体质量、临床诊断、用药情况等）自动计算出华法林推荐剂量。基于此，本研究旨在分析CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性对华法林个体用药的指导价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2020年6月至2021年6月在安徽医科大学附属巢湖医院药剂科治疗药物监测实验室进行CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性检测的住院患者54例，均为汉族人群，其中男31例（占57.4%），女23例（占42.6%）；年龄（75.5±6.8）岁；身高（163.4±7.8）cm；体质量（61.9±10.2）kg；临床诊断：冠心病17例（占31.5%），心功能不全16例（占29.6%），心律失常6例（占11.1%），心力衰竭3例（占5.6%），心房颤动2例（占3.7%），脑梗死2例（占3.7%），风湿性心脏病2例（占3.7%），胸闷2例（占3.7%），急性冠脉综合征1例（占1.8%），心绞痛1例（占1.8%），高血压1例（占1.8%），头晕和眩晕1例（占1.8%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性：AA/AA基因型48例（占88.9%），AA/GA基因型4例（占7.4%），AC/AA基因型1例（占1.9%），AA/GG基因型1例（占1.9%）。本研究已通过安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会审核批准。

1.2 主要仪器和试剂 主要仪器：超净工作台（苏州净化设备有限公司生产，型号：SW-CJ-1FD），旋涡混合器（美国Thermo Fisher生产），电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司生产，型号：DK-S22），荧光检测仪（西安天隆科技有限公司生产，RT-CyclerTM436/TL998A），台式低温离心机（长沙英泰仪器有限公司生产），微量移液枪（芬兰百得实验室仪器有限公司生产）。主要试剂：核酸纯化试剂（西安天隆科技有限公司生产），测序反应通用试剂盒（西安天隆科技有限公司生产）。

1.3 基因多态性检测方法

1.3.1 采集血液样本 采集患者静脉血1～2 ml，置于含乙二胺四乙酸抗凝剂的紫色采血管，采血前患者无需空腹，可正常饮食。由专人将血液样本送至治疗药物监测实验室，4 ℃冰箱保存，24 h内检测。

1.3.2 从血液样本中富集白细胞 在1.5 ml离心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl的预处理液，然后加入200 μl混匀的全血，上下颠倒10次，室温静置5 min，室温3 000 r/min离心5 min（离心半径6.45 cm），之后将上层透明红色液体吸干净；加入1 ml 1×NH4Cl的彻底重悬白细胞，离心后将上层液体吸干净，注意避免吸走管底白细胞。向富集白细胞的离心管中加入30～50 μl核酸纯化试剂，反复吹打混匀，室温静置20～30 min，期间颠倒混匀2次，待检测。

1.3.3 上样 根据待检测的基因位点，取对应的测序反应通用试剂盒，将样本编号标注在试剂管盖上；向相应编号的试剂中加入1.5 μl处理后的白细胞样本（加样时应再次混匀，枪头在管内液体中间吸足1.5 μl样本，若加入量过少会直接影响结果），盖紧管盖，短暂离心后上机检测。

1.3.4 运行 提前打开荧光检测仪，软件为仪器自带的荧光检测软件。仪器进行自检运行，打开荧光检测软件，选择待检测的基因位点，设置待检样本（注意待检样本放入仪器的位置顺序与软件设置的位置顺序一致）；放入样本后开始运行。

1.3.5 结果分析、判读 运行完成后，软件“结果”栏给出样本基因型分析结果。

1.4 华法林治疗情况 根据《华法林抗凝治疗的中国专家共识》［13］，住院患者口服华法林2～3 d后每日或隔日检测INR，直到INR达标（根据既往华人的研究结果，以INR为1.5～2.5判定为达标［14-16］）并维持至少2 d，之后可根据患者具体情况数天至1周检测1次INR，出院后每4周检测1次INR。根据CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性并参照华法林剂量公益网站计算华法林推荐剂量，以华法林推荐剂量±0.2 mg作为华法林推荐剂量范围。比较华法林使用剂量为推荐剂量者与华法林使用剂量为非推荐剂量者华法林治疗2～3 d后INR达标率。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，计数资料以相对数表示，组间比较采用Fisher's确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料及基因分型 54例患者于服用华法林2～3 d后检测INR者23例，其中男14例（占60.9%），女9例（占39.1%）；年龄（75.6±6.5）岁；身高（162.9±8.4）cm；体质量（62.6±12.0）kg；临床诊断：心功能不全11例（占47.8%），冠心病7例（占30.4%），心律失常2例（占8.7%），心力衰竭1例（占4.3%），心房颤动1例（占4.3%），脑梗死1例（占4.3%）；CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因多态性：AA/AA基因型18例（占78.3%），AA/GA基因型3例（占13.0%），AC/AA基因型1例（占4.3%）、AA/GG基因型1例（占4.3%）。

2.2 华法林用药及INR检测情况 23例患者中华法林使用剂量为推荐剂量者11例，华法林治疗2～3 d后INR达标10例；华法林使用剂量为非推荐剂量者12例，华法林治疗2～3 d后INR达标2例。华法林使用剂量为推荐剂量者华法林治疗2～3 d后INR达标率高于华法林使用剂量为非推荐剂量者，差异有统计学意义（P＜0.001），见表1。

表1 23例患者华法林用药及INR检测情况Table 1 Warfarin administration and INR detection in 23 patients

3 讨论

本研究结果显示，54例患者共检测出4种CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因型，分别为AA/AA基因型48例（占88.9%）、AA/GA基因型4例（占7.4%）、AC/AA基因型1例（占1.9%）、AA/GG基因型1例（占1.9%）。既往研究表明，中原地区汉族和回族人群CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A基因突变频率很低，其中携带AA/AA基因型的患者占总体的80%～90%，携带杂交突变基因型的患者占总体的10%～20%［17-19］，本研究结果与之相似，表明本研究样本量虽然有限，但具有代表性。

《华法林抗凝治疗的中国专家共识》［13］指出，华法林最佳抗凝强度为INR介于2.0～3.0之间，此时出血和血栓栓塞风险均最低，不建议低强度抗凝治疗（INR＜2.0），以免增加卒中发生风险。研究表明，在东亚地区，采用低强度华法林治疗（INR为1.5～2.5）的患者与采用最佳抗凝强度治疗（INR为2.0～3.0）的患者心血管死亡率比较无统计学差异，表明低强度华法林治疗较为安全［14］；且该研究结果也在老年心脏机械瓣膜置换术后患者和稳定型冠心病伴心房颤动患者中得到证实［20-21］。TAO等［15］通过人工智能自适应神经模糊推理系统（adaptive neural-based fuzzy inference system，ANFIS）预测个体化华法林的用药剂量，该研究选取中国15个省份21 863例心脏瓣膜置换术后接受华法林治疗的患者为研究对象，通过ANFIS预测患者术后华法林用药剂量并与国际推荐的INR（2.5～3.5）相比，证实中国人需要更低的抗凝强度（INR为1.5～2.5）。另外，华法林中强度抗凝治疗组患者出血事件总发生率高于华法林低强度抗凝治疗组，提示华法林低强度抗凝治疗有助于预防出血事件，安全性更高［16］。上述研究均表明，华法林低强度抗凝治疗可以减少出血发生，且不增加血栓栓塞发生风险。因此，本研究将华法林低强度抗凝治疗（INR为1.5～2.5）作为INR达标的判定标准。

参照华法林剂量公益网站计算出的华法林推荐剂量，本组患者华法林使用剂量为推荐剂量者11例，华法林使用剂量为非推荐剂量者12例，提示临床上仍有很大一部分患者未按照华法林的推荐剂量给药，且存在剂量调整不规范情况，进而导致INR不达标或达标时间延长。本研究结果显示，华法林使用剂量为推荐剂量者华法林治疗2～3 d后INR达标率高于华法林使用剂量为非推荐剂量者，提示按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性推荐华法林用药剂量可提高华法林抗凝效果及用药合理性。此外，临床上还有一大部分使用华法林治疗的患者未进行基因多态性检测，究其原因可能为基因检测费用昂贵，患者不愿意检测。近年来，诸多研究采用IWPC模型计算华法林预测剂量［22-23］，以期减少单纯根据临床经验进行抗凝治疗带来的弊端、科学指导华法林抗凝治疗、降低华法林用药过量导致的出血风险；但其对中国汉族人群华法林用药剂量的预测效果有限，故适合中国汉族人群华法林低强度抗凝治疗药物的基因组学模型仍需大规模临床研究进一步构建。

综上所述，按照CYP2C9*3和VKORC1-1639G>A位点基因多态性推荐华法林用药剂量可使患者INR尽快达标，进而提高华法林抗凝效果及用药合理性。但本研究纳入的样本量较小，基因多态性检测能否真正为临床治疗提供理论依据还需大规模临床研究进一步验证。

作者贡献：丁维剑进行文章的构思与设计，负责撰写、修订论文，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理；丁维剑、苗仁华进行研究的实施与可行性分析，结果分析与解释；汪亚南进行数据收集、整理、分析。

本文无利益冲突。